地鼠克隆胚胎Kcnq1ot1 印记基因的DNA甲基化研究

克隆效率低是动物克隆技术存在的重要问题。核不完全重编程与克隆效率密切相关。而印记基因DNA甲基化导致的印记异常则是核不完全重编程的重要原因之一。地鼠可作为生殖学、肿瘤学等研究方向的优良动物模型，本课题组已对地鼠体细胞核移植进行研究并取得一定成果。在此基础上，本项目拟运用核移植技术和原位杂交、Southern Blotting等分子生物学技术，对正常地鼠胚胎和克隆地鼠胚胎Kcnq1ot1印记基因的表达、Kcnq1ot1的DNA甲基化和基因印记的相关性、以及Kcnq1ot1对Mash2、CDKN1C、KCNQ1三种基因印记情况的影响进行研究。从而阐明克隆动物中Kcnq1ot1 DNA甲基化与基因印记丢失的关系，揭示Kcnq1ot1对相关三种基因的印记调控规律。这将为克隆动物核不完全重编程的机理研究奠定坚实的理论基础，为提高克隆效率提供详实的实验依据，同时也为克隆动物的表观遗传研究提供了新思路。

本项目在前期研究工作的基础上，优化了地鼠体细胞核移植技术的各个环节，从表观遗传学角度研究了地鼠胚胎体外发育阻滞的主要原因，获得了金黄地鼠KCNQ1基因cDNA全序列，且分析了其在地鼠早期胚胎和成年组织中的表达。结果显示，在对地鼠卵母细胞进行显微操作时应将取卵时间控制在hCG后13~15h，采用10μs，300V/mm电脉冲和6-DMAP的联合刺激，可以获得较好的克隆胚胎的激活和发育效果；胚胎在体外发育到2-细胞期时出现阻滞现象，体外胚胎中HDAC1和乙酰化H4K5表达水平显著低于体内胚胎中的表达水平，使得合子激活基因HSP70的转录水平降低，且HDAC1的转录水平也显著下降，影响了合子基因组的激活，导致胚胎体外发育阻滞；克隆出的金黄地鼠KCNQ1基因cDNA全序列长3050bp，其中包括了2010bp的编码区，88bp的5’非翻译区，979bp的3’非翻译区和13个Poly A尾部结构；KCNQ1基因在金黄地鼠早期胚胎的各发育阶段和成年地鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均有表达。结果表明，本研究体系显著提高了克隆地鼠胚胎在2-细胞之前的激活率和发育率，且发现KCNQ1基因在金黄地鼠早期胚胎发育过程中起了重要的调控作用，这将为进一步研究克隆胚胎的体外发育机制，提高克隆胚胎的体外发育率奠定坚实的基础。