核蛋白TRIM28对牛早期克隆胚胎印记基因甲基化维持作用研究

Imprinting problems due to aberrant methylation patterns is one of the most important reasons for the low success rate of mammalian cloning in preimplantation cloned embryos. It has also recently been shown that a maternal TRIM28 can prevent imprinted gene demethylation and resist abnormal development of mice preimplantation embryos, and TRIM28 derived from the oocyte is essential for maintenance of imprinted DNA methylation during preimplantation embryos. The first step of somatic cell nuclear transfer (SCNT) is enucleation, during this step, the nucleus and a small amount of the surrounding cytoplasm are removed from MII oocytes, maternal TRIM28 is localized in the nucleus, the result of enucleation is loss of maternal nuclear TRIM28, maybe it would lead to subsequent failure to maintain methylation imprints in the cloned embryos. Our team made many studies on bovine SCNT and obtained cloned cow. Based on it, we attempted to analyse the expression and distribution of TRIM28 and methylation imprints in the different stages of bovine IVF embryos, SCNT embryos, maternal Trim28-RNAi IVF embryos and zygotic Trim28-RNAi/overexpress SCNT embryos, using molecular biology and embryo engineering technology, such as RNAi, in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) etc. The study aims to determine the relationship between maternal/zygotic TRIM28 and imprinting methylation maintenance, and revealed the role of TRIM28 for imprinting maintenance during bovine preimplantation SCNT embryos. This work provides accurate experimental data for incresing cloning efficiency, and lays the theory foundation for epigenetic regulation reseaches.

早期克隆胚胎印记基因甲基化异常导致的印记紊乱，是克隆效率低的重要原因之一。研究发现母源核蛋白TRIM28是早期胚胎维持印记基因甲基化标记所必需。体细胞克隆过程中，母源核中TRIM28随核及少量胞质从卵母细胞中移除，可能导致克隆胚胎中印记甲基化维持失败。本课题组已对牛体细胞克隆进行大量研究并成功获得转基因克隆牛，在此基础上，本项目拟以牛为研究对象，通过RNA干涉、体外受精（IVF）和体细胞克隆等技术，对IVF胚胎、克隆胚胎、母源TRIM28干扰IVF胚胎和合子TRIM28干扰及过表达克隆胚胎中，TRIM28的表达分布、相应印记基因甲基化状态及印记维持相关基因PGC7等表达分布进行研究，从而初步阐明植入前克隆胚胎不同发育阶段母源及合子TRIM28与印记基因甲基化维持之间的关系，揭示TRIM28在牛植入前克隆胚胎印记基因甲基化维持中的作用。为提高克隆效率提供依据，为其表观调控研究奠定理论基础。

基因组印记是生殖细胞基因组发生父源或母源单等位基因表达的一种表观调控现象。印记紊乱将造成胚胎发生、胎盘形成及生后发育异常。早期克隆胚胎印记异常是克隆技术低成功率的重要原因之一。母源效应蛋白TRIM28在此过程中起重要的调控作用。因此，本研究以牛为研究对象，通过亚硫酸盐测序、RNAi、免疫荧光及荧光定量PCR等技术，分析成熟卵母细胞、植入前不同发育阶段（2细胞、4细胞、8细胞、囊胚）IVF胚胎、SCNT胚胎和TRIM28下调胚胎相应印记基因H19、Mest和Peg10DMRs的甲基化状态、组蛋白H3K9me3和H3K9ac含量分布情况以及TRIM28表达情况，探讨TRIM28在植入前胚胎印记基因甲基化维持中的作用。主要结果如下：.（1）克隆了牛TRIM28基因编码区，并构建了其过表达载体.（2）牛卵母细胞及早期胚胎TRIM28表达水平分析.从GV期到 MII 期直到受精后的2细胞TRIM28 mRNA表达持续升高，2细胞达到峰值，从2细胞到4细胞显著降低，从4细胞到囊胚逐渐升高。IVF胚胎、SCNT胚胎及TRIM28下调胚胎中TRIM28表达趋势基本相似，但是2细胞阶段SCNT胚胎TRIM28 mRNA表达水平显著低于IVF对照（P<0.05）。.（3）下调TRIM28对牛植入前胚胎印记基因DMRs甲基化维持的影响.TRIM28下调对父源印记基因H19具有显著影响，母源TRIM28下调胚胎2细胞阶段H19甲基化水平为1.4%，几乎完全去甲基化，而其IVF对照组2细胞阶段甲基化水平为74%；但是对印记基因Mest和Peg10影响较小。TRIM28下调对使2、4、8阶段胚胎H3K9me3水平降低，H3K9ac水平升高，并对卵裂及囊胚率都产生了显著影响。TRIM28是植入前胚胎印记维持所必需。.（4）TRIM28对牛早期SCNT胚胎印记甲基化维持的作用.SCNT胚胎H19甲基化状态与IVF对照具有显著差异，并与TRIM28下调胚胎具有相似趋势。2细胞阶段，IVF TRIM28 mRNA表达达到峰值，下调胚胎中2细胞印记基因H19DMR甲基化程度显著降低，此时，SCNT胚胎TRIM28 mRNA表达水平也显著低于IVF。体细胞核移植过程，影响了TRIM28的表达，这可能是导致SCNT胚胎印记基因甲基化丢失及表达异常的原因之一。