天然化合物Oblongifolin C调节热休克蛋白70抑制肿瘤细胞自噬的机制研究

Autophagy is the hotspot in anticancer drug research and development. In our previous studies, we have identified that oblongifolin C (OC), isolated from Garcinia species, could inhibit autophagic flux and activate apoptosis in cancer cells. We also found that OC may target the protein of heat shock protein 70.Our research plan focuses on the mechanism study on oblongifolin C by using multiple techniques, including CRISPR-CAS9,BIAcore SPR,Western Blot, live cell imaging, and real time-PCR. Furthermore, we will investigate the molecular mechanisms underlying anti-tumor of OC in the mice cancer model.We expect OC can be a novel autophagic flux inhibitor and may be potential lead compounds for anticancer drug. In summary, our study will provide detailed anticancer mechanism of OC.

细胞自噬信号通路是抗肿瘤药物研发的热点。在前期工作中，我们报道了云南藤黄中的化合物Oblongifolin C（OC）具有通过抑制细胞自噬从而诱导细胞死亡的活性；二维电泳和蛋白质Fishing研究结果显示，OC的可能作用靶点为热休克蛋白（HSP）70。为阐明OC如何调控HSP70蛋白以及HSP70在自噬通路中的作用，本研究将采用BIAcore SPR技术，研究OC与HSP70等热休克蛋白的亲和能力；同时使用凋亡缺失、自噬缺失细胞，结合Western blot，活细胞观察和荧光定量PCR研究OC对HSP70的作用；最后运用CRISPR-CAS9技术建立HSP70基因敲除细胞和动物模型，探讨体内外OC抑制自噬的作用机理。本项目的成果将为OC开发成为新的自噬抑制剂和抗肿瘤药物提供理论依据。HSP70作用的阐明为肿瘤治疗开拓了新的思维方式。

Oglongifolin C （OC）是从云南藤黄提取分离得到的化合物，前期本项目组对OC体内外抗肿瘤活性以及作用机制进行了深入的挖掘。本项目将OC随机包被在聚苯乙烯内表面后，抓取与OC有较高结合力的肿瘤细胞内蛋白，我们发现OC可以和热休克蛋白家族成员HSP70 和溶酶体中蛋白水解酶Cathepsin B结合。用SRP Biacore T200大分子相互作用仪的结果显示OC和HSP70结合能力为52.1 microM,说明OC是HSP70的一个潜在配体。Thermal Shift检测了OC和HSP70共孵育可以显著降低HSP70的Tm值，提示OC与HSP70蛋白的结合能降低蛋白本身的稳定性。为了验证OC与蛋白相互作用，我们设计并合成了OC-biotin作为工具化合物来研究其母核OC与靶蛋白在细胞水平的相互作用。OC-biotin对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，并且不影响OC抑制自噬的活性。OC-biontin能与细胞内HSP70蛋白结合，并且OC-biotin可以与HSP70蛋白在细胞内共定位于细胞质中。OC-biotin抑制热激环境下HSP70蛋白的入核。免疫共沉淀结果结果表明，OC和PES作用于细胞，在不改变HSP90本身蛋白表达的情况下，能增加与HSP70结合的HSP90蛋白。并且OC能下调P53蛋白的表达，却能上调与HSP70结合的P53蛋白量。OC能抑制Cathepsin B的活性。我们使用了Crispr/cas9法，建立了cathepsin B KO 的细胞系。划痕实验显示Cathepsin B KO细胞与未敲除的细胞相比，迁移能力变弱。OC对cathespin B 敲除细胞株诱导凋亡的敏感性降低。动物实验显示,OC可以显著抑制化学物质诱导的肠癌的发生和发展，效果和阳性对照药5氟尿嘧啶类似。本项目，我们开发了全新的实验方法来研究其蛋白作用靶点。本项目通过多种手段验证了OC与HSP70的相互作用，证明OC可能是一个HSP70的潜在抑制机，为进一步阐明OC的抗肿瘤作用机制提供了科学依据。我们首次将protein fishing引入天然产物的靶蛋白研究，并利用不加标记的化合物固定法结合蛋白质质谱完成，验证天然产物与靶蛋白的相互作用。将天然产物在肿瘤细胞上的生物学活性与靶蛋白联系起来，并为天然产物的修饰优化，提高生物学活性提供方向指引，具有一定应用前景。