云南藤黄中Oblongifolin C通过靶向HSP70和TFEB调控自噬的机制研究

Natural compound Oblongifolin C (OC) extracted from Garcinia yunnanensis is the main component for anticancer activity. Our previous study indicated that OC inhibited autophagic flux by blocking autophagosome and lysosome fusion and attenuating proteases activities. However, the protein targets of OC are still unclear. In our preliminary study, we indentified HSP70 and TFEB are the potential protein targets. In addition, these two proteins are closely related to autophagy signaling pathway. In this project, we will apply multiple chemical biology techniques including In silico docking, Biacore SPR to verify the interaction between OC and proteins. By using CRISPR/Cas9 to knockout or plasmid to knockin targeted proteins, we will investigate if the interaction plays an essential role on regulating autophagy pathway. We will use two animal models to investigate the effects of OC with or without targeted proteins expression. The proposed project will provide new evidence on how the Garcinia yunnanensis perform its anticancer activities.

云南藤黄中PPAP类化合物Oblongifolin C（OC）是主要的抗肿瘤活性成分。我们发现，OC可通过阻断自噬小体-溶酶体结合、降低溶酶体中蛋白水解酶活性等方式抑制自噬信号通路。然而，OC的蛋白质靶点尚不明确。在前期工作中，我们通过蛋白质fishing技术确定了OC可能的蛋白质作用靶点是HSP70和TFEB等，文献报道这两个蛋白与自噬信号密切相关。本项目计划通过in silico docking、Biacore SPR等化学生物学手段鉴定OC与蛋白质的结合；通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除及质粒过表达等技术，考察OC是否通过作用于HSP70和TFEB蛋白而发挥作用；进一步通过细胞生物学及动物模型阐明OC调控自噬的作用机制。目前关于天然产物对HSP70和TFEB蛋白的作用及机制罕有报道，本研究将为云南藤黄的抗肿瘤活性药物开发提供科学依据。

本项目对云南藤黄中化合物OC 抗肿瘤作用的机制进行了深入研究。通过蛋白质Fishing技术确定了OC 蛋白质作用靶点是HSP70和TFEB。通过in silico docking、Biacore SPR及Thermo shift 等化学生物学手段鉴定OC与蛋白质HSP70和TFEB的结合，且SPR证明OC结合在HSP70蛋白ATP结合域。 构建 HSP70 敲除过表达的细胞株，考察靶蛋白对OC 抗肿瘤作用的影响。结果表明 HSP70 蛋白的过表达可以抑制 OC 的抗肿瘤作用，同时敲除该蛋白可以诱导肿瘤细胞死亡。该结果提示OC可能通过靶点蛋白HSP70发挥抗肿瘤作用。我们探讨了OC对转录因子TFEB的影响，其可调控溶酶体的活性。结果显示OC可显著增加TFEB的核转入。进一步研究发现OC促进TFEB入核与抑制mTORC1的活性有关。我们同时检测了TFEB荧光素酶的活性，观察TFEB的转录情况，结果发现OC并没有增加TFEB的转录活性，而且还抑制了溶酶体的活性。综上所述，以上结果表明，OC抑制溶酶体活性及自噬过程非依赖于TFEB转入到细胞核。相关研究成果发表 SCI 论文 8 篇；申请中国专利 1 项。为以 HSP70 蛋白为靶标的抗肿瘤天然药物研发提供理论依据，同时为藤黄属植物的综合应用和开发奠定良好基础。