旋毛虫钙网蛋白Ts-CRT与补体重要组分C1q的互作及其在虫体免疫逃避中的作用机制

Inhibiting the complement activation plays an important role in evading from host immune attack for pathogens. In our previous work, it was demonstrated that Trichinella spiralis paramyosin (Ts-Pmy) inhibited the complement activation. However, the parasite can’t totally evade from host complement attack that only Ts-Pmy makes the contribution, and it’s not clear that whether other parasite proteins also involved in this process. This study will focus on the interaction between human complement C1q and a novel T.spiralis calreticulin (Ts-CRT). Firstly, in order to demonstrate the specific binding between C1q and Ts-CRT, Western blot, surface plasmon resonance (SPR) and co-immunoprecipitation will be performed, investigating the mode between C1q and Ts-CRT with template searching and protein-protein docking. Secondly, to explore the effect of Ts-CRT on complement activation, the activation products and hemolysis will be detected. Moreover, to assess the effect of Ts-CRT on the functions of immune cells, the IgM produced by B cell, chemotaxis of macrophages and ROI and RNI produced by macrophages will be tested. Finally, in vitro, to evaluate the effect of Ts-CRT on parasite killing, the adherence of macrophages to NBL and passive transfer assay of newborn larvae (NBL) will be conducted. This study aims to demonstrate that the interaction between C1q and Ts-CRT plays an important role in complement immune attack, as a result, the mechanisms of T.spiralis evading from complement killing could be deeply clarified from overall aspects.

抑制补体系统活化在病原体免疫逃避中起重要作用。我们前期工作发现，旋毛虫副肌球蛋白对补体激活过程具有抑制作用，但单一的虫体蛋白并不足以使虫体完全逃避宿主补体系统的攻击，因而是否存在其他虫体蛋白共同参与了虫体的补体逃避及其作用机制尚不清楚。本课题以旋毛虫钙网蛋白Ts-CRT与补体重要组分C1q的互作为切入点，应用蛋白免疫印迹、表面等离子共振、免疫共沉淀及生物信息学等方法，明确Ts-CRT可特异性结合C1q及两者的互作模式；通过检测补体下游产物的生成，研究Ts-CRT对经典途径激活的影响；应用B淋巴细胞分泌抗体、巨噬细胞迁移及释放活性物质实验，明确Ts-CRT对C1q介导免疫效应细胞功能的影响；通过体外巨噬细胞粘附与杀伤虫体及新生幼虫被动转移实验，评价Ts-CRT在虫体杀伤中的作用。本研究旨在证实Ts-CRT与C1q的相互作用对补体介导免疫杀伤的影响，全方位深入阐明旋毛虫逃避补体杀伤的分子机制。

旋毛虫病（Trichinellosis）是一种重要的人兽共患寄生虫病,旋毛虫能够在宿主体内寄生，与虫体可逃避宿主免疫反应密切相关，因此，阐明旋毛虫的免疫逃避机理有助于制定有效的防控措施。本课题以旋毛虫钙网蛋白（Trichinella spiralis calreticulin, TsCRT）与人补体C1q的互作为切入点，研究其是否可抑制补体经典途径的激活，使虫体逃避宿主补体的攻击。另一方面，研究二者互作是否影响C1q所介导的免疫相应细胞的功能。.首先，克隆表达重组旋毛虫钙网蛋白（rTsCRT），并证实天然构象TsCRT及rTsCRT均可与C1q结合。生物信息学软件定位TsCRT与C1q的结合区域位于TsCRT的S区域（TsCRT-S），并验证其结合区域。.其次，分析二者结合对经典途径活化的影响。首先证实rTsCRT可抑制补体系统经典途径的中间产物C4b、C3b的沉积。其次，绵羊红细胞溶血实验证实，rTsCRT可抑制补体末端膜攻击复合物（MAC）的形成。从而证实rTsCRT与C1q的结合抑制C1q介导的补体系统经典途径的活化。.再次，探讨二者结合对C1q介导的非补体功能的影响。rTsCRT及rTsCRT-S可抑制补体C1q结合于巨噬细胞、中性粒细胞。并且抑制由C1q诱导的巨噬、中性粒细胞趋化迁移。rTsCRT、rTsCRT-S均可抑制由C1q介导巨噬、中性粒细胞活性氧物质及颗粒酶的释放，从而抑制其杀伤能力。.继而，评价二者结合对虫体杀伤作用的影响。rTsCRT抑制了由C1q介导的巨噬细胞对新生幼虫（newborn larvae, NBL）的粘附杀伤。检测虫体ATP证实，rTsCRT、rTsCRT-S与C1q结合后均可抑制C1q介导中性粒细胞的杀伤能力，从而使虫体得以存活。.最后，由于补体活化能够促进中性粒细胞释放胞外捕获网（NETs），NETs参与到一些自身免疫疾病中加重了疾病进程。检测中性粒细胞游离DNA，以及用扫描电镜和荧光共聚焦显微镜观察鉴定，rTsCRT、rTsCRT-S与C1q结合后抑制了补体活化，从而抑制了NETs的形成。.综上，TsCRT与C1q的结合，抑制了补体经典途径的活化及C1q的非补体功能，为进一步阐明旋毛虫免疫逃避机制提供科学依据。此外，在NETs所诱发的自身免疫性疾病的治疗中，rTsCRT-S有望发展为生物治疗制剂及具有潜在的应用前景。