旋毛虫副肌球蛋白与补体经典激活途径启动因子的相互作用及机制研究

Paramyosin is an antigen from Trichinella spiralis found by our research group and patented in China. Previous studies demonstrated that recombinant TsPmy was not only regarded as a potential vaccine candidate, but also indicated important functions in immune evasion. In this study, the ability of TsPmy to bind human complement C1q will be investigated by using ELISA, Pull-Down and MST techniques. Interaction between C1q and TsPmy expressed on the outer membrane of newborn larvae and adult worms will be observed by immunogold electron microscopy and immunofluorescence staining. In order to reveal the influence of TsPmy over classical pathway activated by C1q, the activated components will be quantitated. Finally, the effect of recombinant TsPmy on complement-mediated killing and the mechanisms will be evaluated. This research probes further into the complement regulatory function of TsPmy, and its molecular mechanism leading to the immune invasion.

旋毛虫副肌球蛋白（TsPmy）是由申请者领导的课题组首次发现并获国家发明专利授权的抗原蛋白。前期研究证实，该蛋白除可作为抗旋毛虫病疫苗候选抗原外，还具有免疫调节功能，参与虫体的免疫逃避。为进一步研究TsPmy的免疫调节功能，本项目以TsPmy与补体经典激活途径启动因子C1q的相互作用为切入点，拟应用ELISA、Pull-Down和MST等方法，并结合免疫荧光和免疫电镜技术，明确TsPmy可特异性结合C1q；通过检测补体经典途径中生成产物量的变化，分析重组TsPmy与C1q的结合对经典途径下游反应的影响；通过体外功能试验与虫体杀伤试验，评价TsPmy在补体活化及虫体杀伤中的作用。本项目旨在证实TsPmy与C1q的特异性结合，探明TsPmy在补体经典激活途径中的作用，阐明其对补体介导免疫杀伤效应的影响。从新的视角深入揭示旋毛虫免疫逃避的分子机制，并为诠释人体寄生蠕虫免疫逃避规律提供新思路。

旋毛虫病（Trichinellosis）是一种重要的食源性人兽共患寄生虫病,旋毛虫能够在宿主体内长期寄生，与虫体的免疫逃避密切相关，因此，阐明旋毛虫的免疫逃避机理有利于制定有效的防控措施。本研究通过探讨Ts-Pmy与补体经典途径（the classical pathway）C1q的相互作用，研究其是否可抑制经典途径的激活，使虫体逃避宿主补体的攻击。.首先，探讨Ts-Pmy与人补体C1q的结合。通过ELISA的方法，初步证实重组Ts-Pmy（rTs-Pmy）可与人补体C1q结合，且呈剂量依赖性。Far Western blot的结果表明证实rTs-Pmy可结合于C1q的A链。免疫共沉淀实验结果进一步证实，天然构象Ts-Pmy也可与人补体C1q结合。.其次，分析rTs-Pmy与人补体C1q的结合对经典途径活化的影响。通过Western blot及ELISA实验，证实rTs-Pmy可抑制补体C1s活化片段的生成及激活产物（C3b）的沉积。绵羊红细胞溶血实验证实，rTs-Pmy可抑制补体末端MAC的形成。竞争结合实验结果表明，rTs-Pmy可抑制IgM与C1q的结合，推测rTs-Pmy结合于C1q的头部。.再次，进一步探讨rTs-Pmy与人补体C1q的结合对C1q介导的非补体功能的影响。细胞免疫荧光实验结果显示，rTs-Pmy可抑制补体C1q与巨噬细胞的结合，Transwell实验证实，rTs-Pmy可抑制由补体C1q诱导的巨噬细胞趋化迁移。.最后，评价rTs-Pmy对虫体杀伤的影响。新生幼虫（newborn larvae, NBL）体外粘附杀伤实验结果表明，rTs-Pmy与C1q的相互作用，抑制了C1q介导的单核-巨噬细胞对新生幼虫粘附作用，且该抑制作用呈剂量依赖性；光镜下可见Ts-Pmy能抑制单核巨噬细胞粘附新生幼虫，虫体活力降低；扫描电镜下观察到，加入rTs-Pmy，抑制了巨噬细胞脱颗粒及粘附，虫体表面较光滑。.综上所述，旋毛虫副肌球蛋白通过抑制补体C1q的功能，抑制了经典途径的活化及由C1q介导的非补体功能，为进一步阐明旋毛虫免疫逃避机制提供科学依据。