Nox/NADPH氧化酶诱导的氧化应激在激素性股骨头坏死中作用机制的实验研究

Steroid-induced osteonecrosis of femoral head (ONFH) is an aseptic and ischemic disease developing after steroid therapy. The key pathological.event of steroid-induced ONFH is apoptosis. Previous studies and our preliminary studies demonstrated that oxidative stress is induced during development of ONFH, which plays important role in induction of apoptosis.Meanwhile, high level of Nox4 expression in ONFH was also reported. However, the mechanism of induction oxidative stress in steroid-induced ONFH is remain unclear. The project intends to explore the mechanism through in vivo and in vitro studies :1) To measure expression level of subunits of NADPH Oxidase , Nox1、Nox2 and Nox4 in steroid induced osteoblasts apoptosis and to investigate the apoptotis related pathways;2) introduce siRNA target Nox to clarify the sauce of ROS and induction of.apoptosis;3) To establish rat steroid-induced ONFH model and build Nox siRNA carriers. Then we do intramedullary injection therapy and clear its role in reducing ROS production and apoptosis. To evaluate the curative effect in treating steroid-induced ONFH. This research can provide a new theoretical basis for basic research and clinical drugs development of steroid-induced ONFH.

激素性股骨头坏死是骨科难题之一。激素性股骨头坏死主要病理特征为细胞坏死及凋亡。既往和我们前期研究证实：激素性股骨头坏死病理变化中氧自由基(ROS)水平上升,并高表达NADPH氧化酶家族中的一员。但是Nox途径介导氧化应激反应在激素性股骨头坏死中诱导细胞凋亡的具体分子机制尚不清楚。本项目拟通过体内、体外研究：1）筛查激素-ROS-大鼠成骨细胞凋亡过程中,Nox1、Nox2、Nox4的表达;明确Nox各亚基调控细胞凋亡的机制；2）导入特异性识别Nox siRNA, 验证Nox来源的ROS为调控细胞凋亡的关键信号通路；3）建立大鼠激素性股骨头坏死模型，构建Nox siRNA并行髓内注射治疗，明确并验证其在降低ROS产生、减低细胞凋亡和治疗激素性股骨头坏死中作用和相关机制。本研究将为激素性股骨头坏死的基础研究和临床药物开发提供理论基础。

长期使用糖皮质激素引起的氧化应激严重影响骨组织的修复能力。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶（NADPH）是一种超氧化物生成酶，在调节骨代谢中起重要作用。通过大鼠模型我门证实糖皮质激素性股骨头坏死中存在成骨细胞氧化损伤和凋亡。为了进一步阐明NOX亚型在成骨细胞活性氧（ROS）生成和凋亡中的作用，采用地塞米松建立体外浓度梯度的糖皮质激素环境，证实了随着糖皮质激素剂量的增加，成骨细胞内ROS生成呈剂量依赖性增加，并伴有成骨细胞凋亡增加。加入ROS抑制剂NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)或NOX抑制剂DPI(二联苯碘)可逆转这种效应，表明在大剂量地塞米松刺激下，NOX参生的ROS可诱导成骨细胞凋亡。文献报道证实NOX1、NOX2和NOX4在骨组织中存在表达，为了阐明在成骨细胞ROS生成中起作用的NOX亚型，我们分析了糖皮质激素环境下，NOX1、NOX2和NOX4 mRNA的表达以及NOX2和NOX4蛋白的表达。在100nM、250nM、500nM和1000 nM 地塞米松环境中，NOX1、NOX4 mRNA的表达呈剂量依赖关系，且NOX1的表达更为显著。通过小干扰RNA进一步证实NOX1和NOX4在ROS发生中的作用。为阐明NOX来源的ROS诱导成骨细胞凋亡的信号传导途径，我们对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号分子进行了分析，其中磷酸化ASK1和p38水平在1000nM地塞米松组显著升高，而NAC或DPI可以逆转该过程，而地塞米松组与对照组ASK1、p38基因总的mRNA和蛋白水平无显著差异。这可能是因为ROS在成骨细胞凋亡中调节ASK1和p38的翻译后修饰过程，NOX1和NOX4来源的ROS通过增加ASK1和p38的磷酸化过程在激素诱导成骨细胞凋亡中起关键作用，因此NOX1和NOX4可能是激素性股骨头坏死治疗的重要靶点。