NADPH氧化酶(NOX)在皮肤抗微生物感染屏障中的作用研究

角质形成细胞在皮肤免疫防御中功能活跃，是皮肤复杂生化防御机制的细胞基础, 角质形成细胞产生的抗菌活性分子形成了皮肤的抗菌屏障。2000年以来，在人类基因组中发现一组与吞噬细胞NADPH氧化酶同源的基因（NOX），它们参与机体许多重要的生命活动（包括免疫防御）。NOX基因家族在人体皮肤的生物学功能仍不清楚。我们前期的实验研究提示NOX与皮肤角质形成细胞杀灭胞内细菌紧密相关。本课题将以角质形成细胞杀灭胞内金黄色葡萄球菌为实验模型，探讨角质形成细胞抗菌过程中NOX家族分子的作用；另外因为特应性皮炎患者皮损中常伴有金黄色葡萄球菌感染，我们将比较特应性皮炎患者皮损区、非皮损区及正常人皮肤NOX家族基因的表达水平，以确定NOX与特应性皮炎皮肤金黄色葡萄球菌感染之间的关系。本课题研究结果将揭示皮肤天然免疫防御的新机制，推动皮肤细菌感染发病机制的研究，并为皮肤感染性疾病的防治提供新思路。

本项目按照计划任务书进行，收集人体皮肤标本，使用免疫组化方法，观察NADPH氧化酶家族中DUOX在皮肤表达中的具体定位。培养HaCaT细胞，研究NOX基因表达调控机制。利用金黄色葡萄球菌，炎症细胞因子（TNF-α、 IL-1β、 IFN-γ）、抗炎细胞因子（IL-10、IL-23、IL-4），细菌成分（LPS、MDP），刺激角质形成细胞，提取细胞总RNA，用荧光定量RT-PCR检测NOX基因表达水平变化。建立金黄色葡萄球菌侵袭角质形成细胞模型，动态观察细胞内活菌数量变化，采用炎症细胞因子、佛波酯、胞壁二肽刺激角质形成细胞，观察细胞杀灭胞内细菌能力的变化。收集临床特应性皮炎患者皮损区、银屑病患者皮损区及正常人皮肤活检标本，提取RNA做荧光定量RT-PCR分析NOX基因表达，同时采用免疫细胞染色法观察NOX分子表达情况，比较患者皮损区、非皮损区及正常人皮损NOX表达情况。.免疫组化法检测到DUOX2蛋白在银屑病皮损区、银屑病非皮损区、AD皮损区、AD非皮损区皮肤及正常皮肤标本中均有表达并主要分布在表皮基底层、棘层与真皮乳头层。免疫组化结果显示银屑病皮损组较银屑病非皮损组及正常皮肤组增加（P<0.01）；AD皮损组较AD非皮损组及正常皮肤组增加（P<0.01）；AD皮损组较银屑病皮损组增加（P<0.01）。RT-PCR法检测到DUOX2 mRNA在银屑病皮损及AD皮损中表达。以金黄色葡萄球菌侵入角质形成细胞为实验模型，以平板菌落计数法观察不同浓度下TNF-α，IFN-γ及二者同一浓度联合作用下胞内活菌数量，在40ng/mL浓度下，与对照组比较，IFN-γ组活菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR法提示，DUOX1与DUOX2在银屑病皮损、AD皮损、及正常皮肤中均有表达；AD皮损组DUOX1的表达强于银屑病皮损组及正常皮肤组（P<0.01），银屑病皮损组DUOX1的表达强于正常皮肤组（P<0.01）；银屑病皮损组DUOX2的表达强于AD皮损组及正常皮肤组（P<0.01），AD皮损组DUOX2的表达强于AD皮损组及正常皮肤组（P<0.01），AD皮损组DUOX2的表达强于正常皮肤组（P<0.01）；角质形成细胞在IL-4、 IL-13作用下，DUOX1表达增强（P<0.01）。