NOX4/ NADPH氧化酶4介导的氧化应激在脑出血后继发性脑损伤中的作用及机制研究

Excessive generation of reactive oxygen species (ROS) leads to oxidative stress, which can cause secondary brain injury after intracerebral hemorrhage (ICH). The NOX family of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidases is a group of proteins whose only function is to produce ROS. In our preliminary research, we found that ROS gernerated by NOX2 could cause disruption of blood-brain barrier (BBB) and apoptosis of neuron after ICH. However, as a major source of ROS in brain and cerebral vasculature, the role of NOX4 in secondary brain injury after ICH remains unknown. In this research, the autologous blood injection rat ICH models will be used and the expression and distribution of NOX4 in brain and mitochondria will be examined. Besides that, we will examine the generation of ROS, biomarkers of oxidative stress both in brain tissue and mitochondria. The expression of matrix metalloproteinase (MMP) and NLRP3 inflammasome will be researched. By using siRNA and inhibitors, we will discuss the role and mechanism of NOX4 in mitochondria function, apoptosis of neuron and the disruption of BBB. With the results of this project, it will help us to develop new stratagem for treatment of ICH and improve the prognosis of ICH.

活性氧族(ROS)产生过多导致氧化应激(OS)是脑出血后继发性脑损伤发生的重要机制。NOX/NADPH氧化酶是目前唯一以生成ROS为主要功能的酶类。我们前期研究发现，ROS参与了脑出血后血脑屏障(BBB)破坏及神经细胞凋亡。然而，作为脑内ROS的主要来源之一，NOX4及其产物过氧化氢在脑出血后脑损伤中的作用及机制仍未见报道。本项目拟利用脑出血动物模型，观察脑出血后NOX4在脑内及线粒体上的表达、分布变化，检测脑内及线粒体过氧化氢等ROS产生、组织氧化损伤标志物、线粒体呼吸链复合体活性、MMP表达活性、NLRP3炎症小体活化等的动态变化，结合siRNA等技术手段，探索NOX4及其ROS产物对线粒体功能、神经细胞凋亡、BBB结构功能等的影响，揭示NOX4介导的OS导致BBB破坏、神经细胞凋亡、脑水肿等脑损伤的作用及其分子机制。项目研究有助于阐明脑出血后脑损伤发生的机制，为治疗提供新的策略和思路

活性氧族(ROS)产生过多导致氧化应激(OS)是脑出血后继发性脑损伤发生的重要机制。NOX/NADPH氧化酶是目前唯一以生成ROS为主要功能的酶类。然而，作为脑内ROS的主要来源之一，NOX4及其产物过氧化氢(H2O2)在脑出血后脑损伤中的作用及机制仍未见报道。本项目拟利用脑出血动物模型，探索NOX4介导的OS导致血脑屏障(BBB)破坏、神经细胞凋亡、脑水肿等继发性脑损伤的作用及其分子机制。本研究发现利用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型后，脑组织中的NOX4 mRNA及蛋白表达水平出现异常升高，相应地，H2O2等ROS的含量也出现了不同程度的升高，由此介导了脑出血后组织细胞中氧化应激的发生。我们利用siRNA体内转染技术对大鼠脑组织内的NOX4表达进行敲低，并由此抑制了大鼠脑组织中核酸、蛋白质、脂质等生物功能分子的过氧化程度，借此证明了NOX4在大鼠实验性脑出血后的氧化应激发生过程中的重要地位。随后我们利用免疫荧光染色技术明确了NOX4在大鼠脑组织内的细胞定位，发现了NOX4高度表达于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞及血管内皮细胞中。结合之前的实验手段我们利用凋亡相关检测技术、脑水含量检测技术及BBB紧密连接相关蛋白标记技术等手段验证NOX4介导的氧化应激在脑出血后神经细胞凋亡、神经功能缺损、血脑屏障功能障碍等继发性脑损伤中的作用机制。我们发现NOX4的表达与bax/bcl2/caspase-3介导的神经细胞凋亡通路密切相关并由此加重了大鼠脑出血后神经功能缺损；同时NOX4在血管内皮细胞和星形胶质细胞中介导的氧化应激作用严重影响了BBB紧密连接蛋白的生物学活性，并由此参与到大鼠脑出血后BBB完整性及功能障碍的过程中。本课题为脑出血的临床治疗提供了新的思路，以抗氧化应激为切入点的研究思路及相关验证为临床上脑出血的治疗提供了新的靶标和策略。