原癌基因protodbl上游调控分子的筛选及功能鉴定

Rho家族成员与肿瘤发生发展的关系是近年来研究的热点。鸟苷酸交换因子（Dbl家族）作为Rho家族上游的重要调控分子，在肿瘤发生过程中可能起着决定性的作用。作为Dbl 家族之父的protodbl分子，是首个被发现的鸟苷酸交换因子，其分子调控机制自然成为该领域的研究重点。我们以往的研究中曾发现protodbl 基因的N末端对Dbl的鸟苷酸交换活性具有自我抑制作用。这一结果说明了N末端在protodbl活性调控中的重要性，针对N端的上游调控因子进行深入研究对阐明protodbl的分子调控机制具有重要意义。本研究拟用TAP和Yeast Two-hybrid技术筛选并鉴定与protodbl N端具有相互作用的蛋白分子（目前已得到7个）并进一步研究其对protodbl体内外GEF活性的影响及对正常细胞生物学行为的影响，为揭示protodbl分子调控机制提供新的理论依据。

Rho家族成员与肿瘤发生发展的关系是近年来研究的热点。鸟苷酸交换因子（Dbl家族）作为Rho家族上游的重要调控分子，在肿瘤发生过程中可能起着决定性的作用。作为Dbl 家族之父的protodbl分子，是首个被发现的鸟苷酸交换因子，其分子调控机制自然成为该领域的研究重点。我们以往的研究中曾发现protodbl 基因的N末端对Dbl的鸟苷酸交换活性具有自我抑制作用。这一突破性的结果说明了N末端在protodbl活性调控中的重要性，针对N端的上游调控因子进行深入研究对阐明protodbl的分子调控机制具有重要意义。本课题用Yeast Two-hybrid技术针对protodbl分子的N末端（VL domain：1~498aa）进行筛选，得到一组与protodbl N端具有相互作用的蛋白分子（7个），并用GST-PullDown技术验证了所筛阳性克隆与protodbl体外结合作用，得到三个具有明确体外结合作用的阳性蛋白克隆，并将其与protodbl共转染，研究了其对protodbl的GEF活性的调节作用及其对正常细胞生物学行为（增殖，迁移，侵袭）的影响，最后得到两例具有调控protodbl的阳性蛋白克隆：KIF3B和MAP1B。 另外，为了进一步明确阳性克隆蛋白与VL domain结合的作用位点，我们制备了三个protoDbl VL domain的截断性突变体，分别构建至酵母表达质粒pGBKT7，并使用酵母杂交回复验证并进一步确定所得阳性克隆与VL的相互作用位点。为揭示protodbl分子调控机制打下了坚实的基础，提供了部分新的理论依据。但是，由于酵母双杂交得到的相互作用蛋白表达极其不稳定，有部分阳性克隆的验证工作仍然在进行当中。