溶血磷脂酶在螺原体入侵虾蟹血淋巴细胞过程中作用机制研究

Spiroplasma eriocheiris is a novel pathogen of crustacean and cause heavy economic losses. The phospholipase of pathogens is considered to have very important function in cell invasion and phospholipid metabolism. S. eriocheiris is a microorganism that like to utilize the phospholipid and its genome contains only phospholipase as lysophospholipase. As an important virulence factors, the function of S. eriocheiris lysophospholipase is blank. After cloned, recombinant expressed and antibody prepared of S. eriocheiris lysophospholipase. The characteristic of lysophospholipase will been analyzed by classical method to confirm the effect mechanism, firstly. Secondly, the function of lysophospholipase in S. eriocheiris infected host cells will been analyzed using established S2 cells and Eriocheir sinensis hemocytes infection models by plasmid transfected, antibody block assay, MTT assay, lactate dehydrogenase cytotoxicity assay and oxytetracycline method to determinate infection rate. Finally, the effect of lysophospholipase on phospholipid in E. sinensis hemocytes was quantified by metabonomics analysis. The functionary mechanism of lysophospholipase will be determinated by foundation. And these results will help to understand the molecular pathogenesis of S. eriocheiris.

中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是近年来发现的一种引起虾蟹重大病害的新型病原微生物，磷脂酶在病原菌侵入宿主细胞和磷脂代谢中具有非常重要的功能。S. eriocheiris作为一种喜好磷脂的微生物，其基因组含有溶血磷脂酶基因，这一唯一的磷脂酶，同时也是多种病原体的重要毒力因子，S. eriocheiris的磷脂酶功能还未获得解析，因此本项目在克隆、重组表达溶血磷脂酶蛋白并制备抗体的基础上，利用本实验室建立的果蝇S2细胞和中华绒螯蟹血淋巴细胞螺原体感染模型，通过质粒转染后S2细胞凋亡情况、抗体中和试验、乳酸脱氢酶细胞毒性检测和土霉素法定量螺原体等试验分析溶血磷脂酶的特性，最后用代谢组学方法研究溶血磷脂酶对细胞内磷脂含量的影响，确认溶血磷脂酶在螺原体侵染宿主细胞过程中的功能，为进一步研究螺原体的分子致病机制奠定基础。

中华绒螯蟹螺原体是一种引起虾蟹重大病害的新型病原微生物，磷脂酶在病原菌侵入宿主细胞和磷脂代谢中具有非常重要的功能。通过对中华绒螯蟹螺原体基因组进行比对，发现中华绒螯蟹螺原体中仅含有一种磷脂酶—溶血磷脂酶并将之命名为SE-LsyoPLA，该序列全长927 bp，编码一个232个氨基酸的蛋白，预测的蛋白分子量和等电点分别是35 kDa 和PI 9.64。生物信息学分析，其氨基酸序列含有典型的GXSXG序列，三级结构中Ser-Asp-His三个氨基酸组成了催化三联体。随后成功对SE-LsyoPL基因进行克隆、点突变、原核表达及蛋白纯化。酶活分析表明SE-LsyoPL的最适pH值为7.0左右，最适温度为30℃，在0-30℃温度范围内酶活力较为稳定,温度升高至50℃时, SE-LsyoPL 基本失活，说明SE-LsyoPL是一种温和、中性的磷脂酶。Ca2+、Mn2+ 和 Mg2+对酶的活性没有影响甚至能提高重组SE-LsyoPL的酶活力。研究还发现SE-LsyoPL对长链脂肪酸的水解能力强，对于短链脂肪酸的水解能力弱。利用纯化的SE-LsyoPL重组蛋白成功制备了其多克隆体，抗血清效价在1:70000左右。Western blotting分析表明，SE-LsyoPL是螺原体的一种膜蛋白。实验采用成熟的S. eriocheiri体外侵染小鼠胚胎成纤维细胞（小鼠3T6细胞）的模型进行细胞实验，采用抗体中和实验封闭S. eriocheiri表面的SE-LsyoPL酶位点，土霉素法检测表明当SE-LsyoPL抗体浓度为20 μg /ml时，螺原体在前期对小鼠3T6细胞的侵染率明显下降，螺原体侵染48h后中和实验组中的早期细胞凋亡率要明显低于螺原体侵染组，正常细胞的数量也明显的高于螺原体侵染组。采用间接免疫荧光技术定位螺原体在细胞中的分布情况，结果表明在螺原体感染48h后，中和实验组中螺原体的分布主要成点和状零星状零星状分布，绿色荧光微弱，螺原体主要在宿主细胞的胞膜上分布，而在螺原体侵染组中螺原体在宿主细胞的内部成团状分布，并且已经形成了包涵体，荧光强度高，表明螺原体的侵染要明显的高于中和实验组。以上研究结果都表明当螺原体表面的SE-LsyoPL酶位点被抗体封闭时，螺原体的侵染率明显下降。本研究确认了溶血磷脂酶在螺原体侵染宿主细胞过程中的功能，为进一步研究螺原体的分子致病机制奠定基础。