低温应答基因MdMYB2调控MdSIZ1影响苹果花青苷生物合成研究

Anthocyanin accumulation directly determines red fruit color in apple, which has specific nutrient value. Anthocyanin biosynthesis is affected by many environmental factors, such as temperature and light. From our preliminary study, the SUMO E3 ligase MdSIZ1 mediated MdMYB1 sumoylation to regulate the protein stability, leading to anthocyanin accumulation. However, how MdSIZ1 responding the low temperature signal remains unclear. We analyzed the promoter sequence of MdSIZ1, and found MBS cis-acting element in it. Then, we used the MBS as a bait to perform a yeast-one-hybrid screening, and found that MdMYB2 might interact with the MBS. Therefore, we speculated that the low temperature induced gene MdMYB2 binds to the promoters of MdSIZ1 to modulate its transcription to regulate anthocyanin accumulation. In this study, EMSA, Y1H, and ChIP-PCR assays will be carried out to confirm the binding of MdMYB2 to the promoter of MdSIZ1. Then, we will use transient expression analysis to test the transcription activity of MdSIZ1 by MdMYB2. Finally, transgenic apple callus and plantlets, as well as the VIGS system would be applied to check the anthocyanin content, corresponding gene and protein level in apple. The above results reveal the molecular mechanism of low temperature induced MdMYB2 mediates MdSIZ1 transcription in regulating anthocyanin biosynthesis in apple.

花青苷是决定苹果果实色泽的主要色素，且具有特殊营养价值和保健功能。花青苷合成代谢受温度和光照等多种因素的影响。前期研究发现，低温下SUMO E3连接酶MdSIZ1能将MdMYB1 SUMO化，提高MdMYB1稳定性，促进花青苷积累，但MdSIZ1如何响应低温信号并不清楚。对MdSIZ1基因启动子序列进行分析，发现含有MBS等结合元件。以MBS为诱饵进行酵母单杂交筛库，筛选到低温响应转录因子MdMYB2，推测MdMYB2直接响应低温调控MdSIZ1转录进而影响花青苷积累。本研究拟利用EMSA、酵母单杂交和ChIP-PCR等技术验证MdMYB2与MdSIZ1启动子的结合，并应用瞬时表达技术检测MdMYB2对MdSIZ1转录的调控。最后，通过转基因苹果和VIGS系统检测苹果花青苷积累水平，并分析相关基因和蛋白表达水平，揭示低温诱导MdMYB2调控MdSIZ1转录影响苹果花青苷生物合成的分子机理。

花青苷是植物的次生代谢产物，是重要的天然植物色素。在苹果中，花青苷决定了果实的红色色泽，对苹果的商品价值具有重要影响。在植物中，花青苷由苯丙氨酸开始，经过一系列催化步骤，最终形成。已经证明，由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白组成的MBW蛋白复合体对花青苷代谢途径结构基因的转录调控是植物花青苷代谢调控的主要方式。在苹果中，MBW蛋白复合体由MdMYB1、MdbHLH3和MdTTG1组成。光照、温度、营养元素等外界环境因子可以通过对MBW蛋白复合体组分的影响，调控花青苷在苹果中的积累。在生产上，适度低温逆境可以促进苹果花青苷的生物合成和果实着色，然而，关于苹果如何对适度低温逆境做出响应，进而促进花青苷形成的机理，研究尚不深入。我们前期研究发现MdSIZ1可被适度低温（17℃）逆境诱导。MdSIZ1在17℃条件下将花青苷代谢相关的MBW蛋白复合体中的MdMYB1转录因子SUMO化修饰，增强其蛋白稳定性，进而促进适度低温条件下苹果花青苷的积累。为了找到MdSIZ1上游且响应低温的调节因子，分析了MdSIZ1启动子，发现其上的LTR和MBS顺式作用元件均可对17℃适度低温做出响应，其中MBS顺式作用元件起主要作用。通过酵母单杂交、EMSA和Chip-PCR实验，我们发现MdMYB2可以直接结合在MdSIZ1启动子的MBS结合元件上，转录激活MdSIZ1的表达，影响其对MdMYB1蛋白的SUMO化修饰，从而促进适度低温条件下花青苷在苹果中的积累。最终揭示了适度低温通过MdMYB2-MdSIZ1-MdMYB1途径促进苹果花青苷生物合成的调控途径。本研究取得的结果对于拓展人们对植物，特别是多年生木本果树响应外界逆境环境，维持自身正常的生理代谢过程机制的认识，具有重要理论指导意义，并为品质改良提供了候选基因。