鸭疫里默氏杆菌LuxR家族调控蛋白对细菌毒力的调控机制

Riemerella anatipestifer is a Gram-negative, non-spore-forming, rod-shaped bacterium that causes a contagious disease of ducks, goose, turkeys and various other birds. R. anatipestifer infection occurs as an acute or chronic septicemia in ducks characterized by lethargy, diarrhea, respiratory and nervous symptoms, which led to high mortality and consequently to great economic losses. The LuxR-family regulators play important roles in acyl-homoserine lactones-mediated quorum sensing in Gram-negative bacteria, regulating many bacterial physiological processes such as biofilm formation and the production of virulence factors, extracellular enzymes and secondary metabolites. In our previous study, we found that deletion of AS87_06385 gene significantly decreased the bacterial virulence of R. anatipestifer strain Yb2 (mutant RA253). AS87_06385 gene was predicted to encode LuxR-family transcriptional regulator, and subsequently named ralR for Riemerella anatipestifer LuxR-family regulator. However, to date, the genetic basis for the attenuation of R. anatipestifer ralR mutant has not been defined. This study includes: (1) Detection of the expression level of ralR gene at different growth stages. (2) Determination of biological characteristics of R. anatipestifer ralR mutant. (3) Identification of the target genes regulated by RalR in R. anatipestifer. (4) Study the transcriptional regulation mechanism of RalR in R. anatipestifer; Construction and virulence determination of RalR-regulated gene mutants. (5) Clarify the role of R. anatipestifer RalR on the molecular pathogenesis of the bacteria. This study will benefit for the future prevention and control strategies against the infection.

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种革兰阴性、无芽孢的短杆菌。RA可感染鸭、鹅、火鸡、天鹅等，引起急性或慢性、高致病性、接触传染性疾病。LuxR家族蛋白是革兰阴性细菌的一类重要的调控因子，参与细菌群体感应，生物被膜形成，毒力调控等多种生物学过程。前期研究中我们发现RA AS87_06385基因（编码LuxR-family transcriptional regulator，命名为RalR）与细菌的毒力相关，但其致病的分子机制尚不清楚。本研究的主要内容包括：1. RalR蛋白的表达特性研究；2. ralR突变株的生物学特性和对易感动物的致病性测定；3. RA RalR蛋白调控靶基因的鉴定；4. RA RalR蛋白对靶基因的调控机制研究。5. 阐明RA RalR对细菌毒力的转录调控机制。本项目的研究结果将为鸭疫里默氏杆菌病的预防和控制提供理论基础。

LuxR家族蛋白是革兰阴性细菌的一类重要的调控因子，在细菌的密度感应、质粒转移、生物膜形成及多种胞外酶、毒力因子和次生代谢产物的合成等方面起着重要的作用。前期研究中，我们运用转座子随机突变技术鉴定到鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）的毒力相关基因AS87_06385编码产物是LuxR family transcriptional regulator，命名为RalR （Riemerella anatipestifer LuxR-family regulator，RalR）。并且，RalR蛋白具有LuxR家族蛋白的典型结构特征：C端保守的HTH结构。因此本课题开展了RA LuxR家族调控蛋白RalR对细菌毒力的调控机制的研究。首先，PCR可从不同血清型RA分离株中扩增到ralR基因，表明ralR基因在RA菌株中相当保守。其次，运用实时荧光定量PCR（qPCR）检测RA ralR的表达特性，结果显示ralR的转录水平随着培养时间的延长逐渐由3下降到0.8左右，然后回升并维持在1左右，说明ralR的转录与细菌的群体感应相关。第三，当感染剂量为100 MOI时，突变株Yb2ΔralR对Vero细胞的黏附能力与野生株无显著差异，但其入侵Vero细胞的能力显著低于野生株。第四，突变株Yb2ΔralR对18日龄樱桃谷鸭的LD50为3.83×109 CFU，表明其毒力下降约35,800倍。并且，Yb2ΔralR感染18日龄樱桃谷鸭后，感染鸭血液载菌量在感染后6 h、12 h、24 h和36 h均显著低于野生株。更重要的是，突变株Yb2ΔralR感染的樱桃谷鸭组织器官未见明显眼观病变和组织病理性改变，而野生株Yb2感染的樱桃谷鸭出现了纤维素性心包炎、肝周炎以及脾脏肿大呈大理石样纹等眼观病变，以及心包表面渗出坏死、出血、炎性细胞浸润，肝细胞空泡变性，脾脏组织内淋巴细胞减少等组织病变。第五，链特异转录组测序结果显示：与Yb2相比，突变株Yb2ΔralR中有10个基因出现上调表达，21个基因出现下调表达；qPCR进一步验证突变株Yb2ΔralR有6个基因转录水平上调3倍以上，表明RA RalR可能负调控其他基因的转录。通过本课题的实施，初步证实LuxR家族调控蛋白RalR在RA致病过程中的作用，将为鸭疫里默氏杆菌病的防控提供理论基础。