鸭疫里默氏杆菌整合子对其捕获和表达耐药基因盒效率的调控作用

Integron is a genetic element with the ability to capture and express genes.It acquires drug-resistant genes embedded in exogenous gene cassettes by specific position recombination, offering bacteria with multi-drug resistance. There is a ingenious mechanism for integron capturing exogenous antibiotic resistance gene cassettes,but this mechanism remains elusive so far. The purpose of this study is to probe the regulation of integron capturing and expressing exogenous antibiotic resistance gene cassettes in Riemerella anatipestifer(RA) based on the detailed analysis of the sequence structures of RA class 1 integron. To clarify the self-regulatory effects and regulation mechanisms of the RA integron structures on the recombination frequencies, transcriptional and translational levels of the gene cassettes, the efficencies are measured for RA integron capturing and expressing gene cassettes mediated respectively by different promoter Pants, attC sites, gene cassettes and the distances between gene cassette and Pant by overlap PCR, real time quantitative PCR, SDS-PAGE, Western blot, MIC and MBC antibiotic susceptibility tests. It will provide a theoretical basis for further elucidating multiple-antibiotic-resistant mechanisms mediated by integron gene cassette system, and developing novel drugs to decrease the emerging and dissemination of antibiotic resistance genes in bacteria.

整合子是一种基因捕获和表达的遗传单位，可通过位点特异性重组，获得多种外源耐药基因，使细菌产生多重耐药性。整合子对外源基因盒的捕获存在完整而精细的调控机制，但这一机制尚未明了。本研究在详细分析鸭疫里默氏杆菌（RA）I类整合子序列结构的基础上，探讨RA I类整合子的不同序列结构对其捕获与表达外源耐药基因盒效率的调控作用。从驱动基因盒表达的不同启动子Pant类型、基因盒距离Pant的远近、不同长度的attC位点以及不同类型的耐药基因盒等四个方面，运用重叠PCR、实时定量PCR、SDS-PAGE、Western blot、MIC和MBC抗菌药物敏感性试验等技术，明确RA I类整合子自身构成元件对耐药基因盒捕获频率、基因盒转录和翻译水平的影响，阐明RA整合子捕获与表达耐药基因盒的自身调控作用，为进一步揭示整合子-基因盒系统介导的细菌多重耐药机制及相关新药物的开发提供科学依据。

本项目主要开展了以下七个方面的研究：1）首先采集鸭和猪的组织病料，进行细菌分离鉴定，并对其携带的整合子类型和可变区进行筛查，进而确定I类整合子的结构。2）研究了强、弱两种类型的Pant启动子对基因盒及整合酶转录和表达水平的影响。结果表明，强Pant启动子驱动的基因盒的转录和表达水平明显高于弱Pant启动子驱动的基因盒的转录和表达水平；整合酶的转录水平无明显差异，没有检测到其表达。3）研究了aadA1基因盒位于启动子Pant后第一位和第二位时的转录和表达水平。结果表明，位于Pant后第一位的aadA1的转录和表达水平高于位于Pant后第二位的aadA1的转录和表达水平；整合酶的转录水平无明显差异，没有检测到其表达。4）构建了携带I类整合酶基因的pUC-Int质粒、携带aadA1基因盒的pET-aadA1质粒以及携带Int-aacA4基因的pET-Int-aacA4质粒，依次转化进大肠杆菌JM109，检测重组菌中整合子对aadA1基因盒的捕获效率，但没有检测到整合子对基因盒的捕获。5）研究了四种不同的基因盒（aadA2、aadA5、dfrA12和dfrA17）对基因盒和整合酶转录和表达水平的调控作用。结果表明，基因盒可以调控其自身的转录和表达，但和基因盒的长度无关；基因盒对整合酶的转录和表达无明显影响。6）研究了三种不同长度的attI位点（145bp、157bp、196bp）对基因盒和整合酶转录和表达水平的调控作用。结果表明，不同长度的attI位点对整合酶和aadA1基因盒的转录和表达水平无明显影响。7）研究了四种不同长度的attC位点（69bp、111bp、130bp、153bp）对基因盒和整合酶转录和表达水平的调控作用。结果表明，不同长度的attC位点对整合酶和aadA1基因盒的转录和表达无明显影响。以上研究结果有助于我们进一步理解整合子捕获和表达外源耐药基因盒的机制。