Candida glycerinogenes耐受高浓度2-苯乙醇的调控机制

2-Phenylethanol (2-PE) is a high value flavour and fragrance compound that is utilized in the cosmetics and food industries. The poor tolerance to 2-PE of microorganisms is the key limiting factor in its bioproduction. In this study, the differences in cell physiological metabolism (membrane lipid composition, membrane fluidity, ATP, NADH/NAD+, key metabolites and metabolic pathway flux), proteins expression and genes transcription of the 2-PE-tolerant C. glycerinogenes with different 2-PE stress will be analyzed. Based on this and bioinformatics analysis, the physiological responses and regulatory mechanisms of C. glycerinogenes during 2-PE stress will be uncovered. The engineered strain with improved 2-PE tolerance will be constructed by directively and systematically regulation of the expression level of key genes which is involved in the 2-PE tolerance. Results presented in this study may provide more information about the tolerance mechanisms of microorganism to organic solvent and will also contribute to the bioproduction of organic solvent and whole cells biocatalysis in aqueous-organic mixtures by engineered strains.

2-苯乙醇是一种重要的香料，在化妆品、食品具有广泛应用和重要的商业价值。细胞耐受性是限制生物法合成2-苯乙醇的关键问题。本项目以能耐受高浓度2-苯乙醇的Candida glycerinogenes为研究对象，通过考察不同浓度2-苯乙醇胁迫下细胞生理代谢水平（细胞膜组成、流动性，胞内能荷、氧化还原状态、关键代谢途径和代谢物积累等）、蛋白质表达和基因转录水平上的差异，结合基于基因组的生物信息学分析，系统阐明C. glycerinogenes耐受高浓度2-苯乙醇胁迫的应答和调控机制。基于此，通过基因工程手段定向系统调控细胞耐受关键基因表达水平，获得高胁迫抗性工程菌株。研究结果将丰富微生物细胞有机溶剂耐受机制，对代谢工程改造微生物合成有机溶剂和水-有机溶剂两相细胞催化研究具有一定的参考意义。

微生物发酵是“玫瑰香”天然2-苯乙醇的最佳来源，然而其高细胞毒性已成为生物合成2-苯乙醇产业的瓶颈。本研究以高浓度2-苯乙醇耐受菌株Candida glycerinogenes为研究对象，对其2-苯乙醇耐受响应机制，筛选和应用了抗逆基因元件及上游调控因子并对相关耐受机制进行了研究。具体如下：通过转录组测序发现C. glycerinogenes主要通过增强麦角固醇合成、精氨酸合成、ABC转运蛋白及MAPK信号途径基因的转录表达，下调核糖体合成及中心代谢途径基因响应2-苯乙醇胁迫。利用基因组文库等技术筛选获得抗逆基因元件gsh2，提高gsh2的表达量不仅可以提高菌株2-苯乙醇耐受性，还可显著增强2-苯乙醇产量。通过酵母单杂交、亚细胞定位等细胞生理代谢研究发现：2-苯乙醇胁迫下，调控因子Hap5经翻译后修饰后快速进入细胞核并结合至gsh2基因的启动子CCAAT-box位点激活gsh2的转录水平，产物谷胱甘肽含量随之增加进而缓解了2-苯乙醇压力下ROS积累，脂质过氧化及细胞膜损伤，最终2-苯乙醇的耐受性及产量明显提高。此外，敲除hap5基因显著降低菌株的2-苯乙醇耐受性。在转录组水平上，Hap5主要通过上调DNA修复基因确保遗传信息的稳定性；上调“中心法则”基因增强大分子间遗传信息传递的高效性；激活MAPK信号途径增强下游抗逆基因响应的全面性及上调甾醇合成基因维持细胞膜的完整性增强细胞2-苯乙醇耐受性。本研究挖掘了新的2-苯乙醇耐受调控机制并将其应用于强化2-苯乙醇的生物合成，丰富了微生物细胞有机溶剂耐受机制，为其它菌株的有机溶剂耐受及合成强化改造提供了理论支持和基因资源。