Candida glycerinogenes过量合成甘油过程中渗透压对EMP/HMP途径代谢偏转的调控研究

Candida glycerinogenes is an industrial strain with independent intellectual property rights that can grow rapidly and synthetize glycerol efficiently in high permeability condition, and it is one of the strains that possess highest synthesis efficiency of glycerol in the word. On the base of research platform built by our laboratory for years, this project aims to investigate the regulation on transcription and protein expression of key genes CgTPI, CgZWF and CgGPD and deflection of carbon and energy metabolism in glycerol synthesis with high permeability condition in EMP/HMP pathway, using molecular biology, proteomics and metabolomics methods such as gene knockout, RT-PCR quantitative analysis and product tracking analysis, and two-dimensional electrophoresis blotting analysis. The essence of high yield of the strain at molecular level will be revealed, and a new theory on the high osmolarity glycerol response mechanism and excessive synthesis of glycerol will be obtained. The results provide a platform for the construction of recombinant bacteria with Candida glycerinogenes as host to produce three carbon substances with high additional values such as 1, 3-propanediol and 3-hydroxyl propionic acid.

产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株能在高渗条件下迅速生长、高效合成甘油、具有自主知识产权的工业菌株，是目前世界合成甘油效率最高的菌株之一。本项目拟利用多年来建立的Candida glycerinogenes研究平台，通过基因敲除、RT-PCR定量分析及产物跟踪分析、二维电泳印迹分析等分子生物学、蛋白组学及代谢组学方法，对高渗条件下EMP/HMP途径关键基因 CgTPI、CgZWF和CgGPD在转录水平及蛋白表达水平上的调控、甘油合成途径中碳代谢及能量代谢的偏转进行研究，从分子水平上揭示该菌株高产甘油的本质，获得耐高渗应答调控机制与甘油过量合成途径的有关新理论。研究结果将为Candida glycerinogenes作为宿主通过代谢工程构建基因工程菌株生产1,3-丙二醇和3-羟基丙酸等三碳高附加值生物产品提供平台和依据。

本项目已按计划书完成研究目标，利用自建的C. glycerinogenes分子生物学研究平台，对高渗条件下EMP/HMP途径关键基因在转录水平上的调控、甘油合成途径中碳代谢及能量代谢的偏转进行了较系统研究。成果应用已获得中国轻工业联合会科技进步奖1项，包括2篇未标注共发表SCI及核心论文14篇（计划书要求6-10篇），博硕士学位论文7篇，专利3项，主要研究内容及结果如下：利用基因敲除技术获得C. glycerinogenes甘油合成途径关键基因缺失突变株（Cggpd△，Cgtpi△等）；利用RT-PCR研究了EMP/HMP途径中的关键基因Cggpd、Cgzwf、Cgpfk在不同渗透压下的转录和酶活调节规律，表明高渗下甘油合成期，Cgpfk酶活的提高影响HMP向EMP途径偏转，Cggpd高表达导致流向TCA循环的碳流显著减少。其次，高渗条件下的溶氧控制表明适度溶氧（30%）影响胞内ATP水平及NADH的氧化，从而影响碳流在EMP/HMP的分配，提供足够NADH用于甘油合成；高渗下补料则影响NADH的供给，PYK激酶活力的上升使碳流向 EMP 途径偏转，甘油合成途径的流量相应减小。为研究高渗下HOG途径对关键基因的调节方式，利用ChIP-PCR获得了多个Cghog1调控的靶基因；利用GFP报告系统对其启动子渗透压诱导特征进行分析，表明HOG1通过结合Cgzwf、Cggpd、Cgtpi、Cgstl等启动子上的压力响应原件（STRE）调控其转录表达，从而影响细胞的高渗应答和甘油合成。另外，利用渗透压调控型启动子在C. glycerinogenes中引入“木糖-HMP”代谢途径，对木糖为底物条件下甘油及木糖醇受渗透压调节的发酵及代谢研究进一步验证了PCggpd等启动子受HOG渗透压应答途径的控制。以上研究结果揭示了甘油快速合成时期C. glycerinogenes HOG途径通过调节EMP/HMP途径中重要靶基因（Cggpd、Cgzwf、Cgpfk等）启动子控制其表达水平；PFK、GPD酶活水平明显增加使EMP途径总体碳流加强，碳流量由HMP途径向EMP途径偏转，同时Cggpd的表达迅速上调使碳流主要用于过量合成甘油，TCA循环的碳量减少，这是C. glycerinogenes渗透压应答调控EMP/HMP使甘油过量合成的主要机制。