产酸丙酸杆菌耐受高浓度丙酸的生理调控机制研究

有机酸对细胞生长和产物合成存在反馈抑制作用导致目标产物产量和生产强度较低是有机酸发酵过程中普遍存在的一个关键科学问题。本课题以产酸丙酸杆菌的出发菌株和通过适应性进化获得的三株可耐受不同浓度丙酸（5 g/L，15 g/L，25g/L）的进化菌株为研究模型，结合色谱分析技术、核磁共振技术、二维电泳、质谱技术和基因芯片，比较出发菌株和进化菌株在胞内微环境、代谢网络、蛋白质表达和基因转录水平上的差异，从不同研究水平、不同研究角度全面系统地阐明产酸丙酸杆菌耐受高浓度丙酸的生理调控机制。根据所获得的微生物耐酸生理机制，提出采用代谢工程手段和基因工程技术对产酸丙酸杆菌的代谢进行定向调控的策略，以进一步提高细胞耐酸性能和丙酸合成效率，实现微生物发酵生产丙酸的高产量、高生产强度和高底物转化率的相对统一。这一研究思路及研究结果对工业生物技术特别是微生物细胞耐酸机制研究以及有机酸发酵过程优化具有一定的指导意义。

本项目以产酸丙酸杆菌（P.acidipropioniciCGMCC 1.2230）为出发菌株，通过基因组改组获得了三株可耐受不同浓度丙酸的产酸丙酸杆菌改组菌株，利用微生物生理学和蛋白质组学、代谢组学及定量PCR等技术，研究了产酸丙酸杆菌耐受高浓度丙酸的生理应答和代谢调控，在此基础上提出代谢工程和基因操作手段提高产酸丙酸杆菌耐酸和产酸性能。主要结果为：.1)采用基因组改组技术提高产酸丙酸杆菌的耐酸性。由紫外诱变和DES诱变构建的突变体库用于原生质体融合。经过条件优化和4轮递推式原生质体融合，筛选获得了三株可耐受10、15、20 g/L丙酸的改组菌株。经发酵验证，与原始菌株相比，改组菌株有较好的发酵性能，细胞干重和丙酸产量分别提高了49% 和33.3%。.2)在胞内微环境水平上揭示了产酸丙酸杆菌耐酸机制。与原始菌株相比，改组菌株维持了较高的胞内pH、H+-ATPase比活力、胞内能荷水平和氧化还原水平，积累了较高浓度的精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。H+-ATPase通过消耗ATP将胞内质子泵出胞外，从而维持胞内外pH的动态平衡；NAD+参与细胞许多代谢途径，结合H+还原为NADH并产生大量的ATP；氨基酸通过ADI途径和GAD途径消耗H+生成碱，生成ATP，有利于提高胞内pH。.3)通过基于二维电泳和质谱的蛋白组学技术比较了产酸丙酸杆菌原始菌株和改组菌株蛋白表达的差异。改组菌株通过调控与细胞代谢、电子传递、能量产生和信号传导、物质运输和基因转录、蛋白翻译等相关的24个蛋白的表达，与原始菌株差异显著，关键蛋白经过q-RT-PCR和在大肠杆菌中过量表达，验证与耐酸相关。.4)通过基于LC-TOF-MS的代谢组学技术得到了产酸丙酸杆菌原始菌株和改组菌株中具有显著差异的代谢物，分析了其在丙酸产生途径中的作用，并通过差异组分的添加使丙酸产量提高了41.1%。.5)分析了丙酸产生途径中的酶在原始菌株和改组菌株中的转录水平的差异，揭示转录水平上对丙酸产量有显著影响的关键酶，对代谢工程手段和基因操作技术提高产酸丙酸杆菌耐酸性和丙酸产量具有重要意义。