酿酒酵母2-苯乙醇生物合成全局调控及其毒性机制研究

全局代谢工程是微生物遗传育种的有效手段，本项目从酿酒酵母2-苯乙醇各代谢途径入手，通过阻断分支途径解除其产物的反馈抑制、调控中央代谢途径增加碳流量、解除氮代谢物阻遏、提高底物转运能力、高表达节点基因及转录因子加速限速反应及增强代谢流研究，寻找酿酒酵母莽草酸途径及艾利希途径中调控2-苯乙醇代谢合成的关键元件；探索研究群体感应信号分子- - 芳香醇响应的转录因子在2-苯乙醇生物合成中的调控作用以及对酿酒酵母2-苯乙醇耐受性的影响；利用组学技术对比分析2-苯乙醇耐受菌株与出发菌株在不同条件下的RNA差异表达谱，分析胁迫响应关键因子在酵母2-苯乙醇耐受性及代谢合成中的作用，解析2-苯乙醇毒性机制，寻找新的2-苯乙醇合成的关键调控元件，为利用全局代谢工程理性设计2-苯乙醇代谢途径、系统改造酿酒酵母奠定重要的理论基础和提供新的调控靶点，为高效合成2-苯乙醇提供重要的理论依据。

2-苯乙醇( 2-phenylethanol)是一种具有玫瑰风味的芳香醇，存在于玫瑰、 茉莉等多种植物精油中，也是葡萄酒、黄酒、啤酒、面包等多种发酵食品中的自然风味物质。作为国际香精香料的主流风格，2-苯乙醇在食品和日化用品等领域中有广泛的应用；作为一种杀菌剂在医药行业中已使用多年；2-苯乙醇及其衍生物在治疗心脑血管等疾病方面也有重要作用。. 本研究从酿酒酵母2-苯乙醇各代谢途径入手，通过增加底物流量、解除阻遏及反馈抑制、加速限速反应、改变代谢流及转录因子对代谢途径等调控研究，筛选到了对2-苯乙醇生物合成有正调控作用的重要元件；通过定向进化获得了2-苯乙醇耐受菌株；通过各代谢途径限速因子及转录因子等调控在提高酵母菌抗性中作用的研究，筛选到了有效提高酿酒酵母2-苯乙醇抗性的重要因子。. 在影响2-苯乙醇生物合成的因子中，艾氏途径中氨基酸转氨酶I和II(Aro8p和Aro9p)和苯丙酮酸脱羧酶(Aro10p)的高效表达显著提高了2-苯乙醇的合成能力，2-苯乙醇产量达到3.2g/L，比空载体菌株提高了42%；氨基酸透性酶Gap1p的高效表达提高了艾氏途径底物L-Phe的转运能力，2-苯乙醇产量达到3.1g/L；转录因子Gln3p和Gat1p高效表达增强了ARO9和ARO10的表达，2-苯乙醇产量分别达到3.3g/L和3.2g/L；转录因子Cat8p高效表达后，显著提高了ARO9和ARO10的表达水平，2-苯乙醇合成能力大幅提高，产量为3.6g/L，比空载体对照菌提高了62%，转化率达到97%。. 该项目从整体水平研究了2-苯乙醇的生物合成调控；阐述了Cat8p等转录因子对2-苯乙醇代谢调控的分子机理；初步探索了Cat8p在提高酵母菌2-苯乙醇耐受性方面的作用。研究结果为通过全局代谢工程更加理性化设计2-苯乙醇代谢途径及酵母菌株的系统改造奠定了重要的理论基础。