基于适配体分子信标构象变化的miR-200a测定新方法研究和应用

The Evidences accumulated from many studies have uncovered that distinct patterns of that miR-200a play important roles in a number of cancers. We found miR-200a inhibit UGT 1A1. So, miR-200a represents promising biomarker and target candidates for informative diagnostics and treatment. Therefore, a simple, low-cost, and highly sensitive and selective method for miRNA detection is desirable. We design a novel chemiluminescence (CL) based on conformational swith-based aptasensors fitted with one streptavidin-related aptamer for the detection of miR-200a in this project. Several amplification techniques including the hybridization chain reaction and nanoparticle amplification will be used for the improvement of method sensitivity and selectivity. By using this method, we study that miR-200a regulates UGT1A1 activity. This novel analytical technique can be easily extended to the determination of other miRNA and promote the study of miRNA functions.

miR-200a与多种癌症的发生、发展密切相关，我们发现miR-200a还抑制葡萄糖醛酸转移酶1A1的表达, 因此，可以作为疾病诊断、预后判断及治疗的生物标志物和药物靶标。然而,目前对于miRNA体内测定存在定量不够精确、基质干扰大、操作繁琐复杂、费时、对仪器要求高等问题。因此，开发一种能排除生物基质干扰、简便快速、灵敏度高、低成本的测定分析技术是其功能研究的关键。本课题拟根据我们前期研究结果，构建基于嵌合有链霉亲合素适配体的分子信标构象变化和信号放大的miR-200a化学发光分析新方法，主要致力于设计和优化嵌合有多种识别单元的构象变化型分子信标；应用链替换等温循环和纳米粒子等放大技术，提高方法测定灵敏度和选择性；验证分析方法，并与qRT-PCR方法比较；用于miR-200a抑制UGT1A1的作用研究。本方法易于拓展至其它miRNA测定，有助于miRNA功能的深入研究。

目前，实验室常用的miRNA 检测方法有印迹杂交技术、基因芯片技术、PCR技术，荧光检测技术，电化学检测技术，以及一些色谱和质谱检测方法。这些方法对miRNA的检测起到了重要的作用，但是仍存在一些问题。因此，迫切需要开发简单、快速、灵敏、低成本的miRNA检测技术。本研究在实验室前期研究基础上，开发了多种新型的miRNA检测新方法。.1. 基于适配体构象转化及信号放大的miRNA化学发光检测新方法.以链霉亲合素适配体的构象转化为基础，利用固定化分子信标的“开关”效应，构建具有创新意义的基于适配体构象转化和信号放大的核酸化学发光检测新技术。在本方法基础上，可以设计和发展多种基于适配体构象转化的miRNA化学发光检测新技术，实现对细胞和组织样品miRNA的检测，该法具有操作简便，准确可靠，无需标记的特点。..2. 基于滚环扩增结合实时荧光定量PCR的miRNA检测新方法（RC-qPCR法）.利用vent (exo-) DNA聚合酶同时具有耐高温和链置换活性的特点，将滚环扩增与PCR扩增结合至一步进行，结合了滚环扩增和qPCR方法的优势，使滚环扩增和qPCR能够一步完成，减少了操作步骤，缩短了实验时间，避免了操作过程中反复开管可能引入的污染。已成功应用于细胞、组织样品中miR-200a的定量检测。.3. 基于滚环扩增结合环介导等温扩增的miRNA检测新方法.RC-LAMP法检将滚环扩增与环介导等温扩增这两种等温扩增方法相结合，建立了RC-LAMP法应用于miRNA检测。RC-LAMP法灵敏度与RC-qPCR法相当，但RC-LAMP法的定量上限更高，显示了更宽的定量范围。同时，RC-LAMP法的抗基质干扰能力强于RC-qPCR法，因而可以通过加大总RNA加入量来实现样品中低浓度miRNA的检测。.4. 基于环介导扩增的DNA甲基化检测新方法研究.利用甲基化和非甲基化DNA重亚硫酸盐转化后经LAMP扩增能够产生具有C/T单碱基差异的茎环结构产物，设计链置换探针，实现了通过荧光强度评价目标位点的甲基化程度。环介导扩增作为核酸等温扩增技术之一，摆脱了对精密变温设备的依赖，无论是在实际操作还是仪器要求方面都更为简单方便。