基于“动力学竞争”的普适型适配体比率传感新方法及分子作用机理研究

Difficulty in design of most RNA aptasensors still exists despite the rapid development of aptasensors. The reason can be attributed to the secondary structure after optimization that is hard to bind the target specifically. Herein, the applicant, for the first time, reports a novel sensing strategy that works under “kinetic competition” mechanism, independent on conformation change or reaction equilibrium, simplifying the design of RNA aptasensor. Ratiometric sensing has been one of the hotspots in study of new sensing strategies because it can obliterate the false positive results brought by external factors in traditional sensing. Typically, ricin A chain and its long RNA aptamer are proposed to be our object of study for constructing various of general ratiometric sensors based on the novel “kinetic competition” mechanism. This proposal plans to design and optimize the sensing elements in “kinetic competition” system with the aid of qPCR and CHA amplification, enhancing the sensitivity of detection. The research will provide both theoretical basis and application foundation for further development of “kinetic competition” system by building and perfecting the theoretical model.

当前适配体传感器发展迅猛，但多数RNA适配体传感器的设计仍存在一定难度。其原因归咎于冗长的序列使其在优化和改进后很难再具备能够特异性识别其靶分子的二级结构。为此，申请人首次报道了普适的“动力学竞争”机制下的适配体传感新方法，不依赖于任何构象变化和反应平衡，解决了RNA适配体传感器设计难度高的问题。比率传感是近年来新型传感方法研究中的一个热点，能够避免传统检测法因外界因素而出现的假阳性结果。本课题拟将 “比率计”传感技术与“动力学竞争”模式下的传感体系有机结合，将生物毒素蓖麻毒素A链及其长链RNA适配体视为主要研究对象，创新构建多种基于“动力学竞争”普适型核酸适配体比率检测新技术。本研究主要致力于设计和优化“动力学竞争”体系的传感元素，借助“有酶”qPCR和“无酶”CHA反应等信号放大平台，提高检测的灵敏度，建立和完善“动力学竞争”体系的理论模型，为该机制的深入研发提供理论依据和应用基础。

当前适配体传感器发展迅猛，但多数RNA适配体传感器的设计仍存在一定难度。其原因归咎于冗长的序列使其在优化和改进后很难再具备能够特异性识别其靶分子的二级结构。为有效解决这一问题，本项目将“比率”传感技术与“动力学竞争”模式下的传感体系有机结合，将生物毒素蓖麻毒素A链（RTA）及其长链RNA适配体视为主要研究对象，创新设计了普适的“动力学竞争”机制下的比率适配体传感新方法。该方法既有效地避免了传统检测法因外界因素而出现的假阳性结果，提高了检测的灵敏度、稳定性和可靠性，又无需适配体修饰，不依赖于构象变化和反应平衡，解决了RNA适配体传感器设计难度高的问题。此处设计的基于动力学竞争的适配体传感器利用两种荧光分子对靶标浓度相反响应的比值，建立了与RTA浓度的线性相关关系，实现了对靶标的灵敏检测，对RTA的检测限为0.23 nM，远低于之前报道的基于动力学竞争的电化学适配体传感方法的检测限（30 nM）。在实际样品中的回收率测试中也取得了令人满意的结果，具有实际应用的潜力。另外，为实现传感器的实际应用，我们利用等温核酸扩增技术及链置换反应研发了POCT诊断新方法，利用商品化验孕试纸和血糖仪实现了ATP、凝血酶、埃博拉基因、黑色素瘤的BRAP基因以及诺如病毒的基因等标志物的检测，为动力学竞争的适配体传感器的实际应用打下良好的基础。