基于MRP-GSH-氧化应激的大黄“至尊年高 不可轻用”的毒理学机制研究

Rhubarb can induce chronic nephrotoxicity and hepatotoxicity .Studies show that the toxicological features are different due to different length of time, dose and age. The main component causing toxicity is the Rhubarb Anthraquinone. On the cell organ level Rhubarb Anthraquinone damages mainly on mitochondria and cell membrane. Based on our studies on pharmacokinetics of rhubarb for a long term and the great role palyed by Multidrug Resistance - related Protein(MRP) in keeping glutathione(GSH) anti-oxidation system stable,we develope the ideas that phase - II metabolites of Anthraquinone throug inhibiting MRP produces chronic toxicity induced by Rhubarb which makes the function of GSH anti-oxidation system declining. Further more, severe oxidative stress reaction induces mitochondrial damage, lipid peroxidation and the apoptosis and death of cells. Beacause of the hypofunction of GSH anti-oxidation system with age, the old should take the Rhubarb cautiously. We use cell-evaluating system and gene knock-out animals with a pointcut of age and built a research framework of one center with four part, nodes interferer, corresponding system and interactive analysis. We predict the result though single node and multi-node, analysis the preparation and their metabolites of toxic components quantitatively, evaluate toxicity response respectively, analysis data comprehensively and pay important to cascade effect in order to find the mechanism of toxicity change of Rhubarb with the length of time, dose, age from the angle of metabolism and homeostasis in micro-toxicology.

大黄肝肾毒性客观存在并具有年龄差异性，主要表现为蒽醌类成分导致线粒体与细胞膜损伤。本项目结合前期国家自然科学基金课题(30772764，81001689)对大黄药代动力学和多药耐药相关蛋白(MRP)对维持谷胱甘肽(GSH)抗氧化系统稳态等工作基础，提出"蒽醌II相代谢产物抑制MRP外排功能是大黄慢性毒性反应的启动子，GSH抗氧化系统稳态失控为二级介导，氧化应激加剧致线粒体损伤、脂质过氧化、细胞凋亡与死亡是其毒性终段表现；GSH抗氧化系统功能的年龄差异便造成'至尊年高，不可轻用'的宏观毒性特点"的科学假说。拟采用"一轴四块、节点干预、体系对应、交互分析"研究思路，用细胞学评价与基因敲除动物，从年龄差异切入，单节点及多节点干预猜想主轴，定量致毒成分含量变动，分块评价毒性应答，数据多层互比，重点追溯级联效应，以期从药动学与内稳态关系的全新角度，统一认知大黄毒性时、量与年龄差异性的微观毒理学机制。

本项目以多药耐药蛋白（Multidrug resistance protein , ABCC）为切入点，以ABCC功能、细胞内氧化应激状态、线粒体功能通路为主线，研究大黄素、芦荟大黄素和大黄酸对细胞及整体动物的潜在毒性作用机制，通过对比不同剂量的大黄蒽醌类化合物对青年及老年小鼠肝肾毒性差异，进一步阐明大黄素、芦荟大黄素和大黄酸毒性时、量与年龄差异性的微观毒理学机制。通过CCK-8细胞增殖实验表明，大黄中蒽醌类化合物对HepG2细胞毒性强弱依次为：大黄素 >芦荟大黄素 > 大黄酸 > 大黄素甲醚。Western-Blotting实验表明芦荟大黄素与大黄酸下调HepG2细胞内ABCC2蛋白水平，大黄素可能是影响ABCC2外排功能，造成细胞外排氧化应激产物功能降低，使细胞内氧化应激加剧。通过WB检测凋亡相关蛋白：活化型半胱天冬酶8、9、3以及活化型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶水平，结果显示大黄素、芦荟大黄素和大黄酸激活线粒体凋亡通路，促使HepG2细胞凋亡。通过SalI、NotI酶切位点，构建pCI-neo-ABCC2哺乳动物表达质粒。使用溶酶体抑制剂（氯喹）抑制溶酶体功能，探讨溶酶体在ABCC2降解中的作用；通过WB检测LC3 I/II，以观察芦荟大黄素、大黄酸对HepG2细胞内自噬水平的影响。在HepG2细胞内转染mCherry-GFP-LC3 II质粒，表达带有mCherry和GFP标签的LC3 II蛋白，结果显示芦荟大黄素、大黄酸通过激活自噬促进ABCC2的降解。整体动物方面，通过长期大剂量灌胃给予青年及老年小鼠大黄素、大黄酸和芦荟大黄素，检测血清AST、ALT、BUN、Cr等生化指标，观察小鼠肝肾病理形态学改变，免疫组化法检测小鼠肝肾caspase3蛋白的表达，明确三种蒽醌类化合物对不同年龄阶段小鼠均有不同程度毒性差异。通过检测血清SOD、MDA，肾匀浆中谷胱甘肽抗氧化系统功能，肝脏线粒体膜电位，线粒体对Ca2+诱发肿胀的敏感性，结果表明大黄素、大黄酸和芦荟大黄素可导致氧化系统和抗氧化系统失衡，诱发过度氧化，从而引起线粒体损伤。WB检测ABCC1和ABCC2蛋白的表达，阐示了大黄素、大黄酸和芦荟大黄素与ABCC家族的内在联系。以上研究阐明了大黄毒性时、量与年龄差异性的微观毒理学机制和物质基础，揭示了大黄“至尊年高，不可轻用”的科学内涵。