呼吸跃变型甜瓜果实呼吸跃变过程中乙烯受体及信号转导组分基因表达特性与功能的研究

本研究以典型的呼吸跃变型甜瓜（Cucumis melo L.）品种河套蜜瓜为研究材料，应用Northern杂交技术和实时荧光定量PCR技术，研究呼吸跃变过程中乙烯受体及信号转导组分基因的表达特性，以期发现在呼吸跃变过程中起调控作用的特异表达基因。应用RNAi技术和基因过量表达技术，将特异表达基因在转基因甜瓜中抑制表达或过量表达，观察对呼吸跃变过程的影响，从而阐明乙烯受体及其信号转导组分基因在甜瓜果实呼吸跃变过程中的功能，从乙烯感受及信号转导层面揭示乙烯调控甜瓜呼吸跃变过程的分子机理。河套蜜瓜果实成熟过程中出现乙烯释放高峰和呼吸高峰,乙烯对其呼吸跃变过程具有极其显著的调控作用,本项目研究材料的选择有特色。乙烯调控跃变型果实呼吸跃变过程的分子机制是学术界关注但尚未解决的科学问题。可见，本研究具有重要的科学意义和研究价值。同时，研究结果有望为甜瓜耐贮藏基因工程和果实贮藏保鲜提供新的理论依据。

植物激素乙烯在甜瓜果实发育和呼吸跃变过程中起着重要作用，通过对模式植物拟南芥的分子遗传学研究，已建立从信号感知到转录调控的乙烯信号转导的大致线性模型，即：乙烯→乙烯受体→CTR1→EIN2→EIN3(EIL)→ERF1→乙烯反应。本研究以典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜为研究对象，分别克隆了乙烯受体基因Cm-ETR1、Cm-ETR2以及信号转导组分基因Cm-CTR1、Cm-EIN2、Cm-EIL1、Cm-EIL2、Cm-ERF1、Cm-ERF2的全长cDNA。分析了上述基因的表达特性。分别构建了Cm-ETR1、Cm-ETR2、Cm-ERS1基因的RNAi载体，应用花粉管通道法转化河套蜜瓜，分析了其功能。定量PCR分析结果显示:随着甜瓜果实内源乙烯合成量和成熟程度的增加，果实Cm-ETR1和 Cm-ETR2基因的表达量同步增加，在果实乙烯越变期，Cm-ETR1和 Cm-ETR2的表达量达到最高值。15DAP到45DAP的果实中，Cm-CTR1基因均具有较高的表达。Cm-EIN2在幼叶和花瓣组织中的表达量相似，约为根中表达量的2倍，茎中表达最低，子房中最高。在果实发育成熟过程中，Cm-EIN2基因mRNA水平从20DAP开始缓慢增高，在35DAP达到峰值，随后下降。将幼叶用不同浓度的IAA和ABA处理后，Cm-EIN2基因转录水平减少。Cm-EIL1、Cm-EIL2、Cm-ERF1和Cm-ERF2表达模式与甜瓜果实成熟过程及乙烯生成量正显著相关。上述基因表达分析结果表明，Cm-ETR1、Cm-ETR2、Cm-EIL1、Cm-EIL2、Cm-ERF1、Cm-ERF2基因可能在甜瓜果实呼吸跃变过程中具有关键作用，而Cm-CTR1和Cm-EIN2 可能在甜瓜果实发育过程中发挥重要作用。Cm-ETR1、Cm-ETR2、Cm-ERS1基因的RNAi转基因果实贮藏期比未转基因对照果实长1-2周左右，表明这三个基因在果实成熟和呼吸跃变过程中重要发挥作用。构建了甜瓜果实呼吸跃变期的抑制性差减杂交文库，分离到若干个在呼吸跃变期特异表达的基因，候选基因的定量PCR分析结果显示CSGP（chloroplast stay-green protein）、Chib1(Class III chitinase)、L-Asp（L-asparaginase）和ACO1基因在果实呼吸跃变期特异表达。