表面展示KDR单链抗体的减毒沙门氏菌运载蜂毒素真核表达载体靶向治疗胃癌研究

We have made progress on the melittin and single chain Fv antibody (ScFv) against VEGFR-II (KDR), funded by the last NSFC.For improving the gastric cancer targeting and therapeutic potential of melittin, in this study, Melittin will be expressed in gastric carcinoma by displaying the ScFv on the surface of attenuated salmonella typhimurium, and also the potential of this method will be explored to be applied in clinic in vitro and in vivo. Our investigation will include the following aspects: (1) The ScFv of KDR will be displayed on the surface of attenuated Salmonella typhimurium to increase the targeting and distribution of Salmonella typhimurium to cancer and tumor neovasculature; (2) Melittin expression plasmid will be constructed with COX-2 tumor specific promoter to ensure specificity of melittin in cancer cell, which avoids the toxicity to normal tissues; (3) The tumor specific expression vector was transferred to salmonella typhimurium that displayed KDR ScFv, and the anti-tumor targeting and growth effects will be evaluated in vitro and in vivo. The output of the proposal will provide a new recombinant strain of attenuated Salmonella typhimurium, which targets at gastric carcinoma and tumor neovasculature to enhance the specificity of the expressed melittin in cancer cells. It is hopeful to be a new biological reagent for a convenient and less-side-effect treatment of cancer.

本项目是前一国家自然科学基金项目的进一步深入，在VEGF受体II(KDR)单链抗体和蜂毒素的研究基础上，拟利用减毒沙门氏菌的肿瘤靶向性及其向真核细胞定向运载表达载体的能力，向胃癌细胞内递送表达蜂毒素的真核载体，提高胃癌的靶向性和蜂毒素的治疗效果。研究内容包括：①利用表面展示技术，构建表面展示KDR单链抗体的减毒沙门氏菌，增强沙门氏菌对肿瘤及其新生血管的靶向性；②构建肿瘤特异性COX-2启动子介导的蜂毒素表达载体，确保其只在肿瘤细胞内特异性表达，避免蜂毒素在正常组织细胞内非特异性表达而引致毒性反应；③将表达载体转化表面展示KDR 单链抗体的减毒沙门氏菌，通过体外肿瘤细胞生长抑制试验以及体内荷瘤小鼠胃癌抑制试验评价重组菌的胃癌靶向治疗效果。本研究的预期成果是获得特异性靶向胃癌组织及其新生血管并能向靶细胞内递送特异性表达蜂毒素的基因治疗载体的减毒沙门氏菌，为胃癌的靶向治疗提供一种新型的生物制剂。

本项目是国家自然科学基金青年项目的进一步深入，在获得的VEGF受体II（KDR）单抗的基础上进一步深入研究，拟利用减毒沙门氏菌的肿瘤靶向性及其向真核细胞定向运载表达载体的能力，向胃癌细胞内递送特异性表达蜂毒素的真核载体，研究一种靶向治疗胃癌的新方法。内容包括：（1）利用表面展示技术，构建表面展示KDR单链抗体（ScFv）的减毒沙门氏菌，以增强沙门氏菌对肿瘤及其新生血管的靶向性；（2）构建肿瘤特异性COX-2启动子介导的蜂毒素真核表达载体，确保该载体只能在肿瘤细胞内进行特异性表达，以避免该基因在正常组织细胞内非特异性表达而引致不良毒性反应；（3）将肿瘤特异性表达载体转化表面展示KDR ScFv的减毒沙门氏菌，通过体外肿瘤细胞生长抑制试验以及体内荷瘤小鼠胃癌抑制试验评价重组菌的胃癌靶向治疗效果。结果：项目执行过程中，我们获得了能够表面展示KDR单链抗体的重组沙门氏菌，该重组菌可以通过COX-2启动子表达Melittin。电镜结果显示该重组菌能够感染不同的胃癌细胞；荧光结果显示目的蛋白能在感染细胞内表达，但不同的细胞表达有一定的差异性，在胃癌细胞SGC-7901，MKN45中表达量较高，胃癌细胞系BGC-803，AGS中有一定的表达但表达量相比SGC-7901，MKN45要少一些，在正常细胞中不表达，说明COX-2启动子具有肿瘤特异性。含有蜂毒素基因的重组减毒沙门氏菌能够诱导细胞凋亡，凋亡率达到了48.18%，Western-blot结果显示，重组减毒沙门氏菌通过下调p-AKT和p-KDR的表达诱导胃癌细胞凋亡。体内动物安全性实验结果显示，当口服1×109和注射1×106的重组细菌，小鼠的肝肾功能是正常的，说明该重组菌是安全的。体内细菌分布显示，在感染第3天，肿瘤内就有细菌分布，感染后18天小鼠体内检测不到细菌。小鼠胃癌瘤模型结果显示，带有蜂毒素组治疗效果要优于对照组，肿瘤抑制率达到33.96%，与对照组相比差异显著（p<0.05）；裸鼠荷人胃癌模型显示同样结果，但小鼠的细菌感染量要少，由于裸鼠本身的免疫缺陷。结论：本研究成功获得了特异性靶向胃癌组织及其新生血管、并能向靶细胞内递送特异性表达蜂毒素的基因治疗载体的减毒沙门氏菌，为胃癌的靶向治疗提供一种给药方便、特异性强、副作用小的生物制剂。