结核分枝杆菌的SirR因子与RelJK毒素-抗毒素蛋白之间的交互作用及其调控细菌生长的分子机制研究

Persistence and other complicated growth regulation of Mycobacterium tuberculosis (MTB), has become one of the biggest obstacles in treatment of tuberculosis(TB). However, the involved mechanisms are largely unclear. To address this issue, we will identify the cross-interaction of a repressor of SirR and antitoxin RelJ /toxin RelK basis on previous work ，and further uncover the effect of the interactions on mycobacterial growth. Firstly, we will detect the cross-interaction of SirR and RelJ/K by using the pull-down, surface plasma resonance（SPR）, and immune coprecipitation assays. Secondly, we will analyze the effect of protein interactions on the RelJ/K operon activity as well as the SirR transcription regulation activity by EMSA, SPR and report gene expression assays. Finally, we will illustrate the correlation between cross-interaction and cell growth regulation by constructing recombinant strains (Knockout, Over-expression, and Co-expression) and comparing their growth rate. This study would uncover novel mechanism of regulation of mycobacterial growth, and provide new ideas for the prevention and control of TB.

结核分枝杆菌（MTB）具有复杂的细胞生长调控机制如能形成持续性感染是结核病难以根治的重要原因之一，然而目前对MTB生长调控的分子机制还很不清楚。针对这一科学问题，基于实验室已有的工作，本项目拟在系统鉴定转录抑制子SirR与抗毒素蛋白RelJ以及毒素蛋白RelK三者之间交叉相互作用的基础上，进而探讨它们对MTB生长调控的影响。首先，利用Pull-down、表面等离子共振（SPR）、免疫共沉淀等技术系统分析SirR与RelJ、RelK之间的相互作用。然后，采用凝胶阻滞、SPR和报告基因表达等技术剖析蛋白相互作用对relJK操纵子及SirR转录活性的影响。最后，通过构建重组分枝杆菌菌株（基因敲除、超表达以及共表达等）并比较它们的生长速率，阐明交互作用与分枝杆菌细胞生长调控之间的内在联系。本项目研究将有助于发现MTB生长调控新机制和为结核病的防控提供新思路，具有重要的理论价值和潜在实际意义。

毒素-抗毒素系统通过相对应的蛋白-蛋白之间的相互作用在细菌的生长调控及持续性感染中发挥重要的作用。然而，该系统的调控机制，尤其是该系统与其它功能蛋白之间的相互作用关系却十分不清楚。本研究主要针对结核分枝杆菌（M. tuberculosis）中毒素-抗毒素系统蛋白RelJ/RelK（Rv3357/Rv3358）与转录抑制子SirR（Rv2788）之间具有交叉相互作用开展研究。取得了以下研究成果：1）发现并证实了毒素-抗毒素系统蛋白RelJ/RelK（Rv3357/Rv3358）与转录抑制子SirR（Rv2788）之间在体外体内均具有交叉相互作用；2）证实了转录抑制子SirR（Rv2788）能够发挥与毒素RelK（Rv3358）相似的功能，即转录抑制子SirR（Rv2788）能够调节抗毒素RelJ（Rv3357）的DNA结合活性从而减弱RelJ对其启动子的抑制作用；3）证实了转录抑制子SirR（Rv2788）可能能够取代抗毒素RelJ（Rv3357）从而扭转毒素RelK（Rv3358）的超量表达对细菌生长的抑制作用，毒素-抗毒素系统蛋白RelJ/RelK（Rv3357/Rv3358）均能够减弱转录抑制子SirR（Rv2788）对其自身启动子的抑制作用。本研究有助于了解结核分枝杆菌中转录抑制子SirR（Rv2788）的新功能以及毒素-抗毒素系统新的调控机制。