小黑药中迈克尔反应受体分子的发现及其降脂毒性作用研究

Obesity related chronic metabolic diseases are closely related to lipotoxicity which includes oxidative stress, inflammation and cell injury induced by ectopic fat. Natural Michael reaction acceptors (MRAs) with anti-inflammatory and cytoprotective effects are a class of natural products with potential effects against lipotoxicity. Our preliminary phytochemical investigation on Xiaoheiyao, the medicinal and edible roots of Inula nervosa, has revealed its high content of MRAs. However, the structures and activities against lipotoxicity of MRAs from Xiaoheiyao are still not clear. This project intends to study the chemical basis and bioactivities of MRAs from Xiaoheiyao. Firstly, develop a new method to discover MRAs efficiently from Xiaoheiyao extracts, using GSH functionalized superparamagnetic nanoparticles and LC-MS analyses. Secondly, prepare and clarify chemical structures of MRAs with spectroscopic analyses. Thirdly, evaluate the activities against lipotoxicity of MRAs in vitro cells and further reveal the molecular targets and biding sites of MRAs, using chemical interference methods and micrOTOF-MS analyses, which finally lead to the structure-activity relationship. These study results will provide material basis and scientific reference for the further development of Xiaoheiyao, the development of the intervention strategy against lipotoxicity and the improvement of the health quality of the population.

肥胖相关慢性代谢病与过量脂肪异位沉积诱发的氧化应激、炎症反应及细胞损伤（脂毒性）密切相关。具有抗炎、细胞保护作用的天然迈克尔反应受体分子（Michael reaction acceptors, MRAs）是一类潜在的降脂毒性活性成分。前期筛选发现药食两用植物小黑药（显脉旋覆花的根, Inula nervosa）富含降脂毒性MRAs类成分，但该类成分的化学结构及降脂毒性作用有待进一步研究。本项目拟以GSH亲和磁纳米粒子为介质，建立发现天然MRAs的新方法，结合液质联用技术，明确小黑药MRAs的化学组成；进而指导分离纯化，根据波谱数据确定化学结构；基于体外细胞模型评价降脂毒性作用，采用化学定向干扰、micrOTOF-MS分析等手段研究MRAs与目标蛋白结合位点，总结构效关系。为促进小黑药资源深度开发，发展脂毒性干预策略，提高人口健康素质，提供物质基础和科学依据。

药食两用植物资源小黑药（显脉旋覆花的根, Inula nervosa）具有降低脂毒性、干预脂代谢异常疾病的潜力，但相关活性成分、作用机制缺乏研究。我们根据前期研究推测小黑药含有迈克尔反应受体分子（MRAs），是潜在的降脂毒性活性成分。.根据MRAs的亲电性质，我们采用GSH固定化的磁珠探针，靶向敲出小黑药醇提物中的MRAs。采用UPLC-MS/MS分析及GNPS分子网络技术、多维变量数据分析手段，发现了38个潜在的MRAs组分，鉴定了10个化合物，其中3个为MRAs。.基于1.2 mM混合脂肪酸诱导的HepG2细胞模型，通过测定细胞脂质累积、氧自由基（ROS）水平，评价了小黑药醇提物、石油醚、乙酸乙酯、水萃取部位MRAs靶向敲出前后的作用，证明小黑药MRAs组分具有降脂毒性作用，其中乙酸乙酯部位活性最好。基于GSH亲和磁珠测定了小黑药醇提物不同极性部位MRAs的相对含量，结果发现乙酸乙酯部位MRAs含量高，达0.77 mg/mL甲萘醌当量。深入评价了靶向敲出MRAs组分前后，乙酸乙酯部位干预肝细胞脂肪变性的作用，揭示小黑药MRAs组分在调控细胞氧化还原稳态、脂代谢、线粒体功能方面具有明显作用。.从乙酸乙酯部位靶向分离了主要的MRAs单体，经波谱学鉴定为8,9-环氧-10-异丁氧基百里香酚异丁酸酯（XHY-1）。基于混合脂肪酸诱导的HepG2细胞模型，证明了XHY-1可上调细胞内Nrf2及下游抗氧化基因的表达，提高抗氧化能力；上调PPARα、CPT1A的表达与下调SREBP1c、FAS、ACC1的表达，降低脂质累积水平；上调OGDH、ND1、ATP5A1的表达，提高乙酰辅酶A、NADH/NAD+、线粒体膜电位与ATP水平。基于巯基乙醇定向干扰及MOEdock共价对接，揭示XHY-1的干预作用是通过三元氧环烷基化修饰Keap1 Cys151残基，上调Nrf2信号通路实现的。.此外，基于显脉旋覆花根、茎、叶、花乙醇提取物的HPLC-MS/MS分析，以及化学注释、质谱可视化，绘制了显脉旋覆花不同植物部位的化学空间，揭示了XHY-1的分布情况。分析注释了显脉旋覆花中11类成分、16个化合物；发现根部位XHY-1的含量最高，超出其余部位两个指数量级。.本项目的研究阐明了小黑药MRAs的化学组成、分布规律、降脂毒性作用及机制，为小黑药资源的开发提供了理论依据。