一种干预沙眼衣原体持续性感染的新模式：黄芩苷影响下的CPAF作用途径及关联效应

前期研究发现，黄芩苷可有效地抑制感染细胞内沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)的增殖，且下调Ct效应蛋白-沙眼衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF) 的基因表达。由于CPAF可特异性裂解胞内相关靶蛋白，继而触发一系列促进细胞免疫逃逸、细胞骨架重排、细胞抗凋亡及影响NKT细胞活化等关联效应，有助于Ct的持续性感染。我们推测黄芩苷极可能会以调节CPAF对靶蛋白的裂解水平的方式，干预Ct的持续性感染进程。本项目在前期工作基础上，进一步研究黄芩苷对由CPAF裂解靶蛋白引发关联效应的影响，尤其是如何影响体内诱生的NKT细胞亚群与宿主免疫的保护反应的相互关系。藉此项研究我们试图发现和建立一种干预Ct持续性感染进程的新模式，为更深入了解Ct感染的致病机制和Ct感染疾病的治疗，提供研究资料和实验依据。

目的：.围绕黄芩苷对由沙眼衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF)裂解靶蛋白引发关联效应的影响，发现和建立一种干预Ct(Chlamydia trachomatis，Ct)持续性感染进程的新模式。.研究方法：.1）CPAF裂解靶蛋白引发的体外效应：用HeLa229/PURL/McCoy细胞体外培养Ct，选取不同的时间点及不同浓度黄芩苷干预后（0.27Mm、0.54mM、1.08mM），免疫荧光IF检测Ct包涵体数目及大小。.(1)对感染细胞免疫逃逸功能的影响：Western blot及Realtime-PCR检测CPAF、RFX5及USF1蛋白表达水平；流式检测细胞表面MHCⅠ、CD1d表达。.(2)对感染细胞抗凋亡的影响：Hoechst33258染色荧光显微镜下检测细胞凋亡率；AnnexinV/PI双染流式检测感染后不同时间段凋亡率；流式检测活化的Caspase-3表达水平；Western blot检测唯BH3域前凋亡蛋白Bim、Bik、Puma的蛋白表达水平。.(3)对感染细胞骨架溶解性的影响：鬼笔环肽Phalloidine标记F-actin，IF检测细胞骨架重排效应；Western blot检测CK8蛋白表达水平。.2）NKT细胞功能效应的变化及与DCs的相互作用关系的影响.将Ct生殖道感染的小鼠随机分为黄芩苷处理组和对照组。黄芩苷处理组在Ct感染后24h，加入黄芩苷处理，7天后处死小鼠。通过Real-time PCR及Western blot检CPAF及下游靶分子CD1d的表达水平。通过流式进一步检测了各组中，DCs细胞CD86的表达水平。通过CD1d四聚体染色检测NKT细胞。通过Western blot检测NKT细胞分泌产生的细胞因子IL-4和IFN-γ表达水平。.结果：.1.黄芩苷显著地抑制Ct体外生长，且呈药物剂量效应。同时发现黄芩苷阻碍了Ct感染引发的免疫逃逸效应、抑制了Ct的抗凋亡活性以及抑制了感染细胞骨架重排现象。2.Ct生殖道感染的小鼠经黄芩苷干预后，DCs能识别Ct并进一步分化成熟，分泌IL-12，从而与CD1d分子一起激活、促进NKT细胞的成熟，同时也促进TH0细胞分化为TH1和TH2细胞，从而产生相应的免疫反应来清除Ct。