EphB3通过鸟嘌呤核苷酸交换因子调控癫痫发生及其分子细胞机制研究

As one neural axon guidance factor, the role of EphB3 receptor in abnormal hippocampal neural circuits reconstruction and neural discharges of epilepsy is worthy of further study. We’ve observed that the EphB3 receptor was upregulated and the activity of the EphB3 receptor was enhanced in the brain samples of intractable temporal lobe epilepsy. Using the epileptic rats model induced by lithium chloride/pilocarpine and the epileptic primary hippocampus neurons model induced by magnesium-free, application of the receptor activated and inhibited technique through the fusion protein, gene silencing technique, gene and protein expression detection technique, combined with the neuron-specific staining and patch-clamp technique, we try to elucidate the possible new molecular and cell mechanisms of EphB3 receptor affecting the morphology of neural circuits and neural electrophysiology of the hippocampus through regulating the guanine nucleotide exchange factor and activating its downstream small Rho GTP enzyme signaling molecules, such as Rac1 and Cdc42. Ultimately revealing the EphB3 receptor affects the neural circuits reconstruction and neural discharges by regulating Rho GEF pathway, and elucidating the new molecular mechanism of epileptogenesis. We aim to provide new theoretical basis and therapeutic targets of preventing abnormal neural circuits reconstruction and abnormal neural discharges in the hippocampus of epilepsy.

EphB3为神经轴突导向因子，其在癫痫海马内异常神经环路重建和神经元异常放电过程中的调节作用值得深入研究。本项目拟在前期发现难治性颞叶癫痫标本EphB3表达上调和活性增强的基础上，采用氯化锂/匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型和无镁诱导原代海马神经元癫痫模型，利用融合蛋白激活/抑制受体活性技术、基因沉默技术、基因和蛋白表达检测技术，结合神经元特异性染色和膜片钳技术，研究EphB3通过调节鸟嘌呤核苷酸交换因子及其下游的Rac1和Cdc42等小Rho GTP酶信号分子对海马神经环路形态和神经元电生理的影响。最终揭示EphB3通过对鸟嘌呤核苷酸交换因子的调节来影响神经环路重建和神经元放电，进而阐明癫痫形成的全新分子机制，该研究将为癫痫海马内异常神经环路重建和异常神经元放电的防治提供新的理论依据和治疗靶点。

项目背景：EphB3作为神经轴突导向因子可调节神经网络，而异常的神经网络在癫痫发病中具有重要作用，本课题探讨EphB3通过下游kalirin调节神经元可塑性及微小兴奋性突触后电流参与癫痫发生及可能机制。.主要研究内容：1、干预EphB3活性后对癫痫大鼠行为学、海马苔藓纤维出芽、神经元凋亡、树突棘及突触密度的影响；2、检测Kalirin在难治性颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中的表达情况；3、干预Kalirin后对癫痫大鼠行为学及对海马EphB3的影响；4、在离体海马脑片中干预EphB3活性后，膜片钳检测海马CA1区锥体神经元的兴奋性；5、干预EphB3和Kalirin后，构建癫痫大鼠模型及海马脑片，膜片钳检测海马CA1区锥体神经元微小兴奋性突触后电流情况。.重要结果及关键数据：1. EphB3活性下调可降低大鼠的癫痫发作级别及自发性痫性发作频率、延长发作潜伏期、减轻癫痫大鼠海马齿状回区苔藓纤维出芽、减少CA1区神经元凋亡、降低齿状回内分子层树突棘密度、海马CA1区突触密度及减少突触囊泡数量；而激活EphB3活性具有相反作用；2、筛选出EphB3 下游靶基因为Kalirin及其在在TLE患者脑标本和癫痫大鼠脑标本中表达水平升高；抑制Kalirin可降低大鼠癫痫发作级别和缩短发作潜伏期，而对EphB3活性无影响；3、在离体海马脑片膜片钳试验中，EphB3活性改变可调节神经元兴奋性，激活EphB3活性可引起海马神经元AMPAR-mEPSCs的波幅升高、频率增加，抑制Kalirin具有相反作用，而联合干预能逆转上述两种情况，但它们对NMDAR-mEPSCs的波幅及频率无影响。.结论： EphB3受体通过Kalirin影响大鼠海马神经元树突棘密度、苔藓纤维出芽、神经元凋亡、突触密度、突触囊泡数量和大鼠癫痫发作行为学，其可能是通过调节海马CA1区锥体神经元AMPAR介导的mEPSC参与癫痫的形成，.科学意义：本项目通过干预EphB3活性及Kalirin表达，结合大鼠行为学、形态学、分子生物学及电生理学等技术，在癫痫患者脑组织标本、癫痫动物模型及离体癫痫脑片模型中探讨EphB3与癫痫的关系，进而从分子角度揭示癫痫的发病机制。本研究成果有望为癫痫的临床治疗提供新的方案和药物靶点。