牙龈卟啉单胞菌毒力相关性多糖生物合成基因的研究

在诱导实验动物皮下脓肿形成和宿主细胞表达炎症因子等方面，牙龈卟啉单胞菌菌株间存在着很多差异，但这些差异的分子基础尚不明确。.通过比较牙龈卟啉单胞菌毒力株W83与非毒力株ATCC 33277的基因序列，我们发现在W83的158个毒力相关基因中，10个基因为W83所特有，其中7个为细胞被膜多糖生物合成基因；由于细胞被膜多糖是细菌生命活动中的重要大分子，因而我们推测这些多糖生物合成基因可能与牙龈卟啉单胞菌的毒力特性密切相关。.本课题拟在分离牙周病患者病损部位牙龈卟啉单胞菌，检测多糖生物合成基因在临床分离株中的分布基础上，构建毒力菌株的基因敲除菌株，以W83和ATCC 33277为参考株，对比各菌株导致实验动物皮下脓肿形成的毒力特性，并观测各菌株细胞被膜成分诱导炎症因子表达的能力，从分子水平揭示牙龈卟啉单胞菌细胞被膜多糖合成基因与细菌毒力特性及临床致病性的关系，为进一步的应用研究打下基础。

本项目实施期间，完成了以下研究内容：.1）分离获得5株牙龈卟啉单胞菌临床菌株，利用高通量测序技术，获得各基因组精细图序列，对其多糖生物合成基因在临床分离菌株中的分布进行了分析，选择PG0435基因岛从表达水平进行了重点分析，并通过构建基因敲除菌株研究基因功能。.2）通过鼠脓肿形成实验，获得各菌株的毒力性质；在观察的荚膜厚度的基础上，重点分析了荚膜多糖相关性质及其与菌株毒力特性的关系。.3）提取各菌株多糖成分，在鉴定其脂多糖活性的基础上，通过细胞学实验，从细胞受体识别和诱导细胞因子两方面分析各菌株多糖成分免疫原性及其与细菌毒力特性的关系。.与原计划相比，有两个方面的调整：.1）临床菌株基因水平的研究. 原计划通过PCR检测目标基因在临床菌株中的分布，调整为通过全基因组测序，获得基因组精细图，在此基础上，全面分析了临床菌株的多糖合成相关基因的分布与同源程度，并确定基因功能研究的目标基因。调整原因有二，第一，基因组精细图构建可为后续泛基因组分析打下基础；第二，临床菌株较少，基因组测序成本下降使构建精细图得以实现。.2）荚膜多糖相关性质及其与菌株毒力特性的关系研究. 原计划在动物实验获得毒力特性并筛选毒力菌株的基础上，构建目标基因敲除菌株，再进行动物实验，比较野生株和变异株分析目标基因与毒力特性以及细胞被膜免疫原性的关系，调整为动物实验获得毒力特性后，进行荚膜相关体外性质实验以及细胞多糖免疫原性实验，分析所有菌株的毒力与荚膜的关系。调整的原因是，我们发现，临床菌株荚膜厚度与其毒力的关系与文献报道相反，因而提出假说“以往荚膜厚度与毒力的相关关系多利用标准菌株进行实验获得，还需要使用临床菌株进行验证，其多样性有待全面分析。”，继而，我们增加了荚膜相关体外性质的检测，以及菌株多糖成分免疫原性等实验；在此基础上，按原计划构建标准菌株和2株高毒临床菌株的目标基因变异菌株，然而，多次尝试，我们尚未获得变异菌株，为排除可能的技术以及目标基因的必须性原因，目前我们增加了非必需基因的对照实验。. 在国际及国内会议上发表了部分研究结果，部分内容已以论文形式发表或正在投稿，培养2名硕士研究生和1名博士研究生。