大蒜素对大鼠肝星状细胞胶原生成的调节作用及其相关差异表达基因靶点的筛选研究

肝纤维化是肝硬化演变发展的重要早期阶段，以I型胶原为主的细胞外基质过度沉积是肝纤维化的基础，而肝星状细胞是形成肝纤维化的主要细胞。肝硬化迄今仍缺乏有效的治疗药物。大蒜素是大蒜的主要有效成分，近年少数体内研究初步表明其具有抗肝纤维化作用，可能与降低细胞外基质含量有关，但作用机制未明。本项目拟以肝星状细胞体外研究为切入点，分两个层次进一步探讨该药的作用机理和作用靶点：一、采用组织病理和蛋白分析技术从细胞酶学角度探讨大蒜素对大鼠肝星状细胞胶原生成的调节作用；二、利用抑制性消减杂交和生物信息学分析技术，研究大蒜素对大鼠肝星状细胞基因表达的影响，从不同层次揭示大蒜素的作用机制及可能的作用靶点。本项目着眼于从细胞学和差异转录组学角度揭示大蒜素对肝星状细胞胶原生成功能的影响，对阐释其抗肝纤维化的分子作用机制具有重要基础意义，亦为该药抗肝纤维化治疗提供药理学基础和研究思路。

本课题旨在以肝星状细胞(HSC)为切入点，分两个层次探讨大蒜素(DATS)的作用机理和作用靶点：一、从细胞酶学角度探讨DATS对大鼠HSC胶原生成的调节作用；二、研究DATS对大鼠HSC基因表达的影响。.已完成内容：(1). DATS体外作用的量效参数及时效参数，确定12ug/ml、 24ug/ml分别为低、高剂量组。(2). Hoechst33342染色观察DATS对大鼠HSC的诱导凋亡作用；MTT 法检测DATS对大鼠HSC的增殖抑制作用；BrdU法检测DATS对大鼠HSC增殖的影响。(3). 透射电镜观察DATS影响大鼠HSC超微结构的变化。(4). 流式细胞仪检测DATS对大鼠HSC凋亡的影响。(5). 荧光实时定量PCR鉴定HSC主要细胞外基质及其生成及其降解酶，凋亡相关基因的变化，指标：PⅢP、CⅣ、Bcl-2等。(6). Western blot 鉴定HSC主要细胞外基质及其生成及其降解酶，细胞凋亡相关基因的变化，指标：CⅠ、MMP-13、TIMP-1、bcl-2等。(7). 基因芯片和蛋白质组分析技术分别分析DATS干预后大鼠HSC的差异表达基因谱和差异表达蛋白谱。.本项目从细胞学和差异基因组学角度揭示了DATS对HSC胶原生成功能和凋亡的影响，对阐释其抗肝纤维化的分子作用机制具有重要基础意义。成果：(1). 明确了DATS影响HSC细胞增殖的规律，发现DATS对HSC具有凋亡诱导作用，初步确定DATS不同浓度及不同作用时间对HSC凋亡的影响规律；明确了DATS的量效关系，确定了DATS低剂量和高剂量组的浓度。(2). 初步明确了DATS对HSC细胞诱导凋亡后的亚细胞结构变化规律及细胞周期的变化规律。(3). 初步阐明了DATS对大鼠HSC胶原生成的调节作用。发现和鉴定了部分HSC主要细胞外基质及其生成及其降解酶的变化规律。(4). 获得了DATS干预后大鼠HSC的差异表达基因谱和差异表达蛋白谱，该药物基因组和蛋白质组差异图谱为进一步研究和分析DATS抗肝纤维化的作用靶点及作用机制研究提供了重要线索，初步阐明了DATS的多效性作用机制。.项目实施促进了依托单位石河子大学与中国科学院、广东药学院、中山大学等合作单位的学术交流。培养硕士研究生2名，已经完成论文4篇。参与课题的科研人员基础研究水平得到较大提高。