超低温状态下活性氧对鱼类精子的损伤机制及其调控研究

超低温保存常导致细胞结构、功能遭受一系列损伤。近年活性氧（ROS）对生殖细胞的损伤成为生殖医学及低温生物学研究热点。ROS产生过多常常导致精子脂质过氧化，蛋白质裂解，DNA链断裂。许多文献报道ROS产生、累积可能是精子冷冻损伤中一个重要的原因。然而低温如何诱导精子ROS产生、累积？过量ROS对精子质量产生怎样的影响？由此引起的冻精结构、功能的变化与其生理活性、受精、孵化、子代生长繁育存在怎样的关系？等一系列问题都需要进一步探索。本课题拟以鱼类精子为对象，从质膜结构组成、脂质过氧化、膜完整性，抗氧化酶系统，线粒体功能以及DNA的完整性等方面，从不同角度揭示精子超低温冷冻以及长期超低温贮存条件下ROS的产生、累积以及ROS积累对精子质量的影响规律。以期阐明超低温状态诱导产生的ROS对精子质量损伤机理，进一步揭示和丰富种质细胞超低温保存损伤理论，优化冷冻保存技术。

首先利用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶（X-XO）系统对真鲷精子建立体外活性氧生成模型，不同剂量的的X-XO对真鲷精子的运动率影响差异显著，活性氧可以显著降低精子的运动率，且运动率与活性氧的生成量呈负相关。 体外中等剂量X-XO处理真鲷精子，可通过添加外源抗氧化剂（牛磺酸、海藻糖、抗氧化酶-SOD），减少活性氧对精子的损伤，显著提高其运动率、质膜完整性和线粒体功能正常的精子所占百分比，延长解冻精子在4℃下的保存寿命；通过对真鲷精子的体外模型及冻存对比，可以得出，在精子的冷冻保存过程中确实产生了活性氧，并对精子的结构和功能产生了损伤，且在精子冷冻保存过程中通过添加外源抗氧化分子如牛磺酸或海藻糖可以优化鱼类精子超低温保存方法，提高冻精质量；但是在冷冻保存过程中，添加外源抗氧化分子对抗氧化酶SOD,CAT,GSH及MDA含量并无显著性的改变。不同年份的真鲷精子，其活性氧含量随着保存时间的延长呈递增趋势，运动率、运动寿命呈下降的趋势。保存9，20，32，43个月的精子膜电位差异不显著，保存79个月的高膜电位精子比例显著低于保存9个月的精子。我们推测抗氧化分子可能通过与活性氧作用，降低活性氧对冻精的质膜完整性、线粒体功能和膜电位的损伤作用；但真鲷不同年份冻精的人工授精结果显示，不同年份的冻精受精率、孵化率差异不显著。同时我们还采用液相和质谱联用技术结合单细胞拉曼图谱测定的方法，对真鲷、夏鲆、太平洋鳕鱼、鞍带石斑和红点石斑精子的7种脂质成分和含量进行测定，探索不同鱼类精子与低温敏感性差异密切相关联的物质基础。