绿针假单胞菌GP72利用甘油-葡萄糖合成吩嗪-1-羧酸的机制解析及高产工程菌的构建

Shenqinmycin is a novel and effective biological pesticide developed by our lab, and phenazine-1-carboxylic acid (PCA) is a potent component, which is synthesized from precursors erythrose-4-phosphate (E4P) and phosphoenolpyruvate (PEP) through the shikimic acid pathway. Preliminary studies indicated that PCA production by P. chroloraphis GP72 was improved when the mixture of glycerol and glucose was used as carbon source, but mechanism underlying this phenomenon is still not clear. In this project, carbon metabolism and metabolic flux distribution will be investigated to elucidate mechanism underlying intracellular accumulation of E4P and PEP in P. chroloraphis GP72. On the one hand, the pathway of glycerol catabolism will be intensified to increase the conversion rate of glycerol to dihydroxyacetone phosphate. On the other hand, the role of catabolite repression control (Crc) protein and transcriptional regulators in glucose catabolism pathway on the metabolism of glycerol-glucose mixture will be identified. By using 13C-labled glycerol and glucose and qRT-PCR analysis, the metabolic intermediates and metabolic flux distribution will be investigated to diagnose targets for metabolic engineering of the strain in order to improve intracellular accumulation of E4P and PEP. Combined with metabolic pathway modification, an engineered P. chroloraphis GP72 strain will be constructed for PCA overproduction and will ultimately improve PCA titer and productivity by the study of fermentation kinetics and process optimization. The results can provide theoretical research and reference for high production of other phenazine antibiotics and value-added compounds.

申嗪霉素是本单位研发的新型高效生物农药，其有效成分为吩嗪-1-羧酸（PCA），通过莽草酸代谢途径由前体4-磷酸赤藓糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成。前期研究发现采用甘油-葡萄糖混合碳源能提高绿针假单胞菌GP72的PCA产量，但分子机制尚不清楚。本项目拟研究该菌株在利用甘油-葡萄糖时的代谢机制和碳代谢流分布，解析E4P和PEP胞内积累规律。首先强化甘油代谢途径，提升甘油代谢速率。进而考察代谢物阻遏控制蛋白Crc及葡萄糖代谢调控蛋白对甘油-葡萄糖代谢的调控作用，接着以13C标记葡萄糖和甘油为底物，结合qRT-PCR等分析手段，研究代谢中间产物和代谢流分布，寻找代谢工程改造靶点，提高胞内E4P和PEP积累水平。再结合代谢途径改造，构建高产PCA工程菌株，并结合发酵动力学研究和发酵过程优化，提高PCA发酵活性和生产强度。研究结果可为其他吩嗪类抗生素及高附加值化合物的高产提供参考和借鉴。

申嗪霉素是一种高效、低毒的新型生物源农药，其有效成分为吩嗪-1-羧酸（PCA），通过莽草酸代谢途径由前体赤藓糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成。已有的研究发现，假单胞菌中 E4P供应相对不足是限制莽草酸途径以及PCA产量的主要因素之一。因此本项目强化绿针假单胞菌GP72甘油代谢速率，解析胞内E4P的积累规律，采用甘油-葡萄糖混合碳源强化胞内E4P的供给，并以此构建相应的PCA高产工程菌株。研究首先通过敲除基因glpR、mgsA和过表达glpF和glpK，强化甘油转化为磷酸二羟基丙酮的速率。接着我们发现菌株GP72胞内E4P主要来源于非氧化磷酸戊糖（PP）途径，并在代谢甘油的过程中存在一个受HexR调控，由部分糖异生途径、氧化PP途径和ED途径组成的EDEMP循环。因此，我们采用过表达基因tktA、fbp和敲除基因pgi增加6-磷酸果糖（F6P，E4P 合成的前体）的供给，同时添加葡萄糖恢复PP途径的代谢流。采用甘油-葡萄糖混合碳源，改造后的工程菌株胞内PEP和E4P的比例由9.5：1降至3.5：1，其供应的不平衡性得到有效改善，PCA的产量比对照菌株提高了2.2倍。比较代谢组学的数据表明胞内 F6P和莽草酸的浓度分别增加2 倍和1.3倍。在此基础上，通过敲除吩嗪类化合物合成途径的负调控因子、强化莽草酸关键步骤基因、抑制分支酸直接分流途径等策略构建PCA高产工程菌株，结合发酵条件优化，PCA的最终产量达到7.2 g/L，是出发菌株的251倍。另外，我们在绿针假单胞菌建立了CRISPR辅助的碱基编辑系统，该系统能有效地催化目标窗口序列中碱基对C:G到T:A的变化，可高效用于基因失活、点突变、碱基替换等。再者，针对PCA产量提升导致的活性氧胁迫的情况，采取两阶段发酵的策略，使2-羟基吩嗪的产量提高为原来的1.6倍，并通过比较转录组学和代谢组学分析了添加二硫苏糖醇（DTT）提升PCA产量的机制，发现添加DTT后，菌株通过氧化还原、吩嗪合成、磷代谢以及外排泵等方面的调控，使碳流更多地流向吩嗪类化合物的合成。以上研究成果为降低PCA的工业化生产成本和技术推广奠定了基础，也为其他吩嗪类衍生物及高附加值化合物的高产提供参考和借鉴。