绿针假单胞菌GP72中吩嗪类化合物合成的正向自调控机制研究

It is necessary to improve the productivity of phenazines and study the biosynthetic mechanism of phenazines, as the natural phenazines are a kind of important agricultural antibiotics. It is found that the foreign phenazine-1-carboxylic acid (PCA) addition could enhance the biosynthesis of phenazines including PCA and 2-OH-PHZ in Pseudomonas chlororaphis strain GP72 in the previous study. The positive autoregulation of PCA shows that PCA may involve in the cell metabolism. In order to elucidate the positive autoregulation mechanism and role of PCA in GP72, the steady isotope 13C tracer technique is adopted to study the metabolic process of PCA in GP72, the metabolic flux and nodes will be determined at the different addition of PCA based on the proportion analysis of isotope 13C. The quorum sensing regulation, expression of biosynthetic genes and some important regulators, and the reaction kinetics of PCA will be studied. Based on the analysis of relationship between metabolic flux and main genetic expression, the network of metabolic process will be set up to elucidate the positive autoregulation mechanism and role of PCA in GP72 and explore the possibility to eliminate or weaken the feedback of products 2-OH-PHZ. At last, the productivity of phenazines will be improved by changing the metabolic passways and flux of PCA and genetic regulation. This study is helpful to discover the new positive autoregulation mechanism of other antibiotics biosynthesis and realize the high production of antibiotics by eliminating or weakening the product feedback.

作为广谱的农用抗生素，天然吩嗪类化合物的高效合成研究非常必要。前期研究发现绿针假单胞菌GP72中外源吩嗪-1-羧酸(PCA)对PCA、2-OH-PHZ等吩嗪类化合物的合成有正向自调控作用，表明PCA参与了细胞的代谢过程。为阐明其自调控机制和代谢作用，本项目采用13C稳定同位素示踪法研究GP72中PCA的代谢机制，研究比较不同外源PCA添加量下相关代谢流的变化和代谢节点的确定。结合假单胞菌群体感应调控机制研究、PCA和2-OH-PHZ合成基因与重要调控基因的表达分析、PCA合成2-OH-PHZ的生物反应动力学，综合分析代谢流变化和重要基因表达的关系，阐明PCA的自调控机理，探索解除或减弱其产物反馈抑制的方法。通过基因代谢调控、PCA相关代谢途径和代谢流的改造，实现PCA和2-OH-PHZ的高效合成。并为其他抗生素正调控机制的发现、产物反馈抑制的减弱和高效合成的实现提供借鉴。

作为广谱的农用抗生素，天然吩嗪类化合物的高效合成研究非常必要。前期研究发现绿针假单胞菌GP72中外源吩嗪-1-羧酸(PCA)对PCA、2-OH-PHZ等吩嗪类化合物的合成有正向自调控作用，表明PCA参与了PCA的合成代谢过程。为阐明其自调控机制和代谢作用，本项目采用13C稳定同位素示踪法结合代谢组学研究绿针假单胞菌中PCA的代谢机制，建立了代谢组学和转录组学相结合的微生物代谢过程研究方法，基于中间产物与目标产物的13C丰度，确立了吩嗪代谢流计算方法，建立了代谢流模型。研究比较PCA对绿针假单胞菌生长和代谢流的变化影响，以确定PCA合成的关键代谢节点。完成了产生PCA的绿针假单胞菌GP72及HT66的基因组分析和比较基因组分析，以及蛋白质组学分析，并通过基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学的综合分析与对照，进一步确定和证实PCA可能参与的各种代谢过程和代谢节点。鉴于分支酸是PCA合成前的关键节点，阻断分支酸旁路代谢，增加分支酸合成代谢。采用Red重组系统对合成辅酶Q、合成苯丙氨酸和酪氨酸、合成色氨酸等5条代谢途径逐一无痕敲除，提高分支酸流向合成PCA途径。.系统研究了绿针假单胞菌的吩嗪合成群体感应PhzI/PhzR调控系统，鉴定了群体感应AHL信号分子，研究了PhzI/PhzR调控系统的功能。研究表明绿针假单胞菌中PCA可以作为吩嗪类化合物合成的信号分子，通过群体感应调控，对吩嗪类化合物合成起正调控作用。基于合成基因PhzO的功能，建立了PCA合成2-OH-PHZ的反应动力学。研究了绿针假单胞菌中吩嗪类化合物合成的调控网络，通过pykF、rpeA、rsmE、lon等多个负调控基因的敲除；吩嗪合成必经的莽草酸途径的加强，选取ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE六个莽草酸途径关键酶，实现在菌株GP72中过表达，成功构建了多株基因工程菌株，实现PCA和2-OH-PHZ的高效合成，吩嗪化合物的摇瓶产量达到1.5g/L， 2-OH-PHZ产量达到450mg/L。本项目的研究思路和技术方法可为实现其他抗生素的高效合成提供借鉴。经过4年的研究，本项目培养了研究生12名，发表SCI收录论文9篇、中文研究论文5篇、公开发明专利2项。