Sphingmonas wittichii DP58 降解吩嗪-1羧酸的代谢机制研究

Shenqinmycin is a kind of novel, efficient agrochemicals from microorganism. However,the degradation behavior of its major component,phenazine -1-carboxylic acid (PCA), in the environment has little been reported. This research project will attempt to illustrate the biodegradation pathway of PCA by a PCA degrading bacterium, Sphingomonas wittichii DP58, at the molecular and biochemistry level by centering on the initial key enzyme of PCA biodegradation. Firstly, the aromatic ring-hydroxylating dioxygenases(ARHDs) in the strain will be tested by the methods of RT-PCR, genes knockout and genes heterogeneous expression in order to determine the initial ARDH for PCA biodegradation.Then the biochmeical characteristcs and catalytic mechanism of the enzyme will be studied. In addition, the position of the gene clusters in the genome containing this dioxygenase will be located and the function of this gene cluster and its upstream and downstream genes will be analyzed. Finally，the genes which functions are closely related to PCA degradation will be cloned and heterogeneous expressed and their catalytic performances will be investigated by using 13C labelled PCA in order to establish the biodegradation pathway of PCA by Sphingomonas wittichii DP58 .This research can provide basic data for the safe use of Shenqinmycin and a sound theoretical foundation for improvement the control effect of PCA. Moreover, this research could do much help for the degradation of other nitrogen-containing heterocyclic compounds by Sphingomonads.

申嗪霉素是一种新型、高效的生物源农药，但其有效成分吩嗪-1-羧酸（PCA）在环境中的代谢行为目前还鲜有报道。本课题以一株能高效降解PCA 的Sphingomonas wittichii DP58 为研究对象，以PCA降解代谢途径中的初始关键酶为核心，拟在分子和生化水平上阐明该菌株降解PCA 的代谢机制。首先结合课题组前期基因文库筛选和基因组测序结果，通过RT-PCR、基因敲除和异源表达实验确定该菌株降解PCA 的初始芳烃羟化双加氧酶，并研究该酶的生化特性以及催化机制。然后对该酶基因的上下游基因进行功能分析，异源表达其中与PCA 降解密切相关的基因，同时添加13C标记的PCA，通过酶催化实验来解析和完善该菌株降解PCA 的代谢途径。本研究一方面为申嗪霉素的安全使用提供基础数据，另一方面为提高申嗪霉素的防治效果奠定扎实的理论基础，同时对其他含氮杂环化合物的降解研究具有重要的参考价值。

申嗪霉素是一种新型高效的生物源农药，但其有效成分吩嗪-1-羧酸（PCA）在环境中的代谢行为目前还鲜有报道。本课题首先对一株能高效降解PCA 的菌株Sphingomonas wittichii DP58 进行PCA降解时的转录组分析，发现表达上调倍数最大的3个加氧酶编码基因位于同一个基因簇中。接着通过系统发育分析，发现其中的一个双加氧酶PcaA1属于苯甲酸类降解双加氧酶，表明PcaA1A2可能兼有PCA脱羧功能。再通过异源表达和全细胞转化研究，发现只有基因pcaA1A2A3A4一起表达时才能将PCA转化为1,2-二羟基吩嗪。说明pcaA1A2A3A4编码PCA降解的芳烃羟化初始双加氧酶（命名为PCA 1, 2-双加氧酶）。其功能是催化PCA脱羧和羟基化形成1, 2-二羟基吩嗪。. 为了进一步研究PCA 1, 2-双加氧酶的催化特点和酶学特性，我们分别将pcaA1A2、 pcaA3和pcaA4克隆并进行异源表达和纯化。 SDS-PAGE分析发现，PcaA1A2由两个亚基组成，其分子量约为46和17 kDa。体外酶促反应结果表明，PcaA1A2、PcaA3和PcaA4是转化PCA必需蛋白，说明PCA 1, 2-双加氧酶是IV型三组份双加氧酶。PCA 1, 2-双加氧酶可以利用NADH和NADPH为电子供体，但使用NADH为电子供体时酶催化活性是使用NADPH的20倍。凝胶过滤分析发现PcaA1A2的活性蛋白分子量为190 kDa，说明该酶是α3β3的组成结构。对PCA 1, 2双加氧酶进行底物专一性分析发现，PCA 1, 2-双加氧酶还可以转化邻羟基苯甲酸为邻苯二酚，但不能转化苯甲酸和2-OH-PCA。. 另外，为了验证菌株S. yanoikuyae B1中编码联苯双加氧酶基因bphA1fA2fA3A4是否可以催化吩嗪的加氢和羟基化，我们在大肠杆菌中异源表达了该基因并进行全细胞催化。结果表明，该双加氧酶可以将吩嗪转化为1, 2-二氢 1, 2-二羟基吩嗪。另外，对菌株B1中的基因bphA1f敲除和回补的实验表明基因bphA1fA2f是菌株B1中吩嗪降解的唯一初始双加氧酶编码基因。. 本研究一方面为申嗪霉素的安全使用提供基础数据，另一方面为提高申嗪霉素的防治效果奠定扎实的理论基础，同时对其他含氮杂环化合物的降解研究具有重要的参考价值。