基于高效莽草酸途径的绿针假单胞菌细胞工厂的构建研究

Because of its strong ability to synthesize metabolites efficiently and adapt to the environment and increasingly clear genetic background, Pseudomonas is of the foundation to become a cell factory. PGPR Pseudomonas chlororaphis HT66 showed the efficiency of the shikimate pathway in phenazine synthesis, while shikimate pathway is a common metabolic pathway of aromatic amino acid synthesis process, and can be derived to synthesize many important compounds. This project utilizes the efficient shikimate pathway of strain HT66, tries to clone foreign genes and reconstruct new metabolic pathways at the upstream and downstream of the shikimate pathway respectively. By reconstructing two secondary metabolites of muconic acid and 3-enolpyruvoylanthranilate synthesis pathway and transforming one natural synthesis pathway of 4-hydroxy-benzoic acid, it will be studied that the expression of exogenous genes and the synthesis of target products respectively. And then by transformation of metabolic pathways, enhancement of synthetic approaches and metabolic regulation, the efficient biosynthesis of target products would be realized. Eventually strain HT66 would be transformed into cell factory, and the shikimate pathway could be as a basic element in synthetic biology to synthesize derived products from shikimate pathway. In the project it is explored to construct cell factory from different angles of the shikimate pathway in Pseudomonas chlororaphis. The study will lay a good foundation for construction of Pseudomonas cell factory and utilization of shikimate pathway, and help to investigate the expression of foreign genes in Pseudomonas chlororaphis.

假单胞菌具有高效的合成能力和强大的环境适应能力，其遗传背景日益清晰，具备了作为细胞工厂的条件。绿针假单胞菌HT66在吩嗪合成中表现出莽草酸代谢途径的高效性，而莽草酸途径是芳香族氨基酸等合成过程中的共同代谢途径，能够衍生合成许多重要化合物。本项目利用HT66菌株的高效莽草酸途径，分别选择在莽草酸途径的上游和下游改造代谢途径，引入外源基因，改造一个天然的4-羟基苯甲酸合成途径，并人工构建两个新代谢产物的合成途径，研究各目标产物合成可行性，从而分析外源基因的表达与适配性的规律。进而通过途径改造、合成途径强化和基因调控实现各产物的高效合成。最终将HT66改造成为优良细胞工厂，将莽草酸途径作为合成生物学的一个基本模块，用于高效合成莽草酸途径衍生产物。本项目从莽草酸途径的不同角度探索构建产物合成途径，将为莽草酸途径的利用及假单胞菌细胞工厂的构建打下良好基础，并为分析外源基因与表达宿主的适配性提供借鉴。

假单胞菌具有高效的合成能力和强大的环境适应能力，其遗传背景日益清晰，具备了作为细胞工厂的条件。绿针假单胞菌HT66在吩嗪合成中表现出莽草酸代谢途径的高效性，而莽草酸途径是芳香族氨基酸等合成过程中的共同代谢途径，能够衍生合成许多重要化合物。本项目利用HT66菌株的高效莽草酸途径，分别选择在莽草酸途径的上游和下游改造代谢途径，引入外源基因，改造一个天然的4-羟基苯甲酸合成途径，人工构建新的产物合成途径。.本研究完成了3个目标产物粘康酸、OPA、4-羟基-苯甲酸的合成途径构建，并在此基础上利用高效的莽草酸途径在其下游构建了6种新型吩嗪类产物、朱砂精酸等衍生产物合成途径；利用改造后的羟基苯甲酸合成途径，进行了合成熊果苷、龙胆酸等研究；还基于吩嗪合成途径的对比确定了邻乙酰氨基酚及寻霉素A的合成途径；基于小基因组策略，构建了适合吩嗪合成的绿针假单胞菌底盘细胞。上述相关产物均为生物医药品或工业化学平台产品，有不同的应用价值。项目研究了各目标产物高效合成的可行性，分析了外源基因的表达与适配性的规律。进而通过途径改造、合成途径强化和基因调控实现了部分产物的高效合成，如4-羟基-苯甲酸可稳定积累2g/L，黏糠酸和熊果苷的发酵产量分别达到3.4 g/L和6.8 g/L，朱砂精酸的产量达到136.2 mg/L。.最终研究表明将莽草酸途径作为合成生物学的一个基本模块，绿针假单胞菌可以改造成为用于高效合成莽草酸途径衍生产物的优良细胞工厂。本项目从莽草酸途径的不同角度探索构建产物合成途径，将为莽草酸途径的利用及假单胞菌细胞工厂的构建打下良好基础，并为分析外源基因与表达宿主的适配性提供借鉴。.