基于FDA标记畸胎瘤细胞联合人胎盘屏障体外模型建立中药胚胎毒性评价体系的研究

Traditional Chinese medicine has significant effect on the diseases of pregnancy and pregnancy complications. Due to the lack of embryotoxicity evaluation method, the development of TCM has been restricted. The cells come from target organ can be used to study drug toxicity on target organ. Embryonic carcinoma originated from the multipotential function germ cells is common germ cell tumor of ovary. It can be used to establish a cell model for screening embryotoxicity of drugs . Drugs affected the embryo have to through the placental barrier during pregnancy , so it has great clinical significance only to evaluate embryotoxicity of pharmaceutical ingredients which through the placental barrier. An in vitro model for human placental barrier with characteristics and biological function of in vivo placental barrier has been established by us, the pharmaceutical ingredients which through the placental barrier of psoralen and Shuanghuanglian using HPLC-MS has been tested. This project aims to establish cell model of screening embryotoxicity by fluorescence diacetate(FDA) labeled human teratocarcinoma cells, and then to establish high throughput and high content embryotoxicity evaluation system with characteristics of TCM , combined with human placental barrier model in vitro and HPLC-MS. Finally Scutellariae Radix, psoralen, Ahizoma Arisaematis and Shuanghuanglian will be evaluated using the system. This project will contribute to promote the globalization of TCM, and accelerate the modernization of TCM.

中药对妊娠病及妊娠合并症具有显著疗效，由于缺乏符合中医药特点的胚胎毒性评价方法严重制约了中医药的广泛应用。毒靶器官来源的细胞可用于定向研究药物对靶器官的毒性。畸胎瘤是常见的卵巢生殖细胞肿瘤，起源于具有多潜能分化功能的生殖细胞，可用于建立筛选药物胚胎毒性的细胞模型。妊娠期药物只有透过胎盘屏障才可能对胚胎产生影响，只有对透过胎盘屏障的药物成分进行胚胎毒性分析，才有临床价值。课题组前期建立了具有在体胎盘屏障组织学特性和生物学功能的人胎盘屏障体外模型，并应用HPLC-MS技术检测了补骨脂、双黄连透过胎盘屏障的药物成分。本项目拟应用荧光探针标记人畸胎瘤细胞，建立胚胎毒性筛查细胞模型，同时联合应用人胎盘屏障体外模型、HPLC-MS技术，建立符合中医药特点的、高通量、高内涵的妊娠期应用中药胚胎毒性评价体系，评价示范药黄芩、补骨脂、天南星、双黄连的胚胎毒性。促进中医药与国际接轨，加速中药产业现代化进程。

中药对妊娠病及妊娠合并症具有显著疗效，因缺乏符合中医药特点的胚胎毒性评价方法制约了中药在妊娠期的应用。课题组前期联合人胎盘屏障体外模型、EST实验及HPLC技术，建立了较为完整的中药胚胎毒性评价体系，研究过程中发现①EST实验采用的是鼠源胚胎干细胞，所得实验结果存在种属差异；②MTT 法评价受试物对ESC的增殖毒性，灵敏度欠佳且抗杂质干扰能力差，影响结果的准确性。③体外培养ESC分化为具有收缩能力的心肌细胞的数量作为评价受试物对ESC分化毒性的指标，不能全面地评估受试物对ESC的分化毒性，假阴性率高且技术要求高、耗时长。因此，寻找新的细胞模型、优化增殖毒性评价方法、寻找新的分化毒性评价指标是进一步优化和完善中药胚胎毒性评价体系的三个关键点。.本课题围绕以上三个关键点，进行了以下研究工作：（1）通过碱性磷酸酶实验、多能性基因表达、体内/体外分化实验及生物学稳定性的评价证实人卵巢畸胎瘤细胞（PA-1）具有无限增殖及多向分化的干细胞生物学特性，可以作为评价药物胚胎毒性的替代细胞模型。（2）通过共聚焦成像、线性、稳定性及准确性考察，验证DAPI、Calcine -AM、PI共染进行高内涵筛选可快速筛查受试物对PA-1细胞的增殖毒性，因此，高内涵筛选技术可以作为评价受试物增殖毒性的方法；（3）RT-PCR技术检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog 在PA-1细胞诱导分化过程的表达变化并应用阴/阳性对照药验证Oct4、Sox2和Nanog可作为评价受试物对PA-1细胞分化毒性的评价指标。高内涵筛选技术联合多能性基因检测可同时评价受试药物对PA-1细胞的增殖毒性及分化毒性，建立了评价药物胚胎毒性的快速筛查方法。.将药物胚胎毒性快速筛查方法与人胎盘屏障体外模型、HPLC技术相结合进一步优化和完善了中药胚胎毒性评价体系，建立了符合中医药特点的妊娠期应用中药安全性评价体系，并应用该体系完成了对4味示范中药透过胎盘屏障药物成分分析及胚胎毒性考察。将该体系在行业内乃至世界范围内推广，将促进中药胚胎毒性研究领域的进展。