piggyBac介导体外高灵敏药物代谢、毒性评价肝细胞体系的建立

Primary hepatocytes as the "gold standard" have been widely used in drug metabolism and safety evaluation. With limited lifespan, primary hepatocytes cannot be functioned as a cell-based screening system. It has been known the reactive metabolites would play a significant role in hepatotoxicity. The use of common hepatoma cell lines for evaluation of drug-induced hepatotoxicity is limited since the lower expression of cytochrome P450s, drug metabolizing enzymes. This would limit the production of the reactive metabolites and thus it is not suitable for safety estimation for drug candidates. Genetically manipulated cells constitute promising tools to overcome such defection for a regenerated hepatocyte system. To study gene expression differences of drug metabolizing enzymes, here we propose to systematically characterize the gene expression profiles of drug metablizing enzymes in four common hepatoma cell lines. The low-expressing genes of the drug metablizing enzymes will be transfected into the corresponding hepatoma with piggyback. The expression levels, stabilitiy of enzymes, enzymatic activity, and toxic reaction against reactive metabolites will be evaluated in these different cell lines. The known bioactivable drugs will be applied to examinate the resulting celllines. This would confirm the novo hepatoma celllines with relible and high expression of drug metabolizing enzymes for drug safety evaluation.

原代肝细胞作为"金标准"被广泛应用于药物代谢、药物毒性等研究中。由于原代肝细胞缺乏可传代性而不能作为稳定的细胞系使用。药物经体内代谢产生化学活性代谢产物引起肝细胞损伤坏死，被认为是药物导致肝毒性主要原因之一。而常用可以传代的肝肿瘤细胞系其代谢酶表达水平显著低于人原代肝细胞，阻碍了其在药物肝细胞水平上进行毒性研究的应用。尤其是欠缺足够的化学活性代谢产物，限制其在药物安全性评价应用的可能。因此为了提高细胞系内代谢酶的表达水平，增强其对生物活性药物的毒性敏感性，本研究选择四种常见肝肿瘤细胞系应用高效piggyBac转座子基因转移技术，将多个差异表达人源药物代谢酶一次性转入相应人源肝肿瘤细胞中，建立表达多种代谢酶稳定高效的人肝肿瘤细胞株。通过比较基因导入后不同细胞系内酶的表达、活性、稳定性及细胞对生物活性药物的毒性反应，筛选建立一系列灵敏可靠的药物代谢、代谢物毒性研究的的体外细胞模型。

药物经体内代谢产生化学活性代谢产物引起肝细胞损伤坏死，被认为是药物导致肝毒性主要原因之一。因此在体外细胞水平进行药物肝毒性的评估是药物研发过程的重要环节。人原代肝细胞常被认为是药物代谢及毒性研究的“金标准”细胞，但由于来源缺乏、体外传代次数有限且代谢酶表达不稳定，限制其进一步广泛应用。而常用的肝细胞系体外可无限次传代，但是细胞内的药物代谢酶水平较低，阻碍了其在药物代谢肝毒性研究的应用。因此本研究选择高效piggyBac转座子基因转移技术，以实现单个或多个药物代谢酶插入细胞基因组TTAA位点，以实现代谢酶高效稳定表达，获得更加灵敏的药物代谢肝毒性细胞模型。.本研究选择并克隆5种主要代谢酶基因CYP3A4、CYP2C8、CYP2A6、CYP3A5、CYP2C19，构建系列荧光标记的单基因转座子系统及多基因转座子系统。选择体外基因操作更加简便的hepG2细胞。通过单基因转座子系统结合细胞单克隆技术，可实现代谢酶的高效稳定且均一的表达，转基因细胞株在体外传代P20/P30/P40时，基因表达、蛋白水平、酶活性均持续高水平。针对多基因共表达，项目共设计单转座子多基因系统和多转座子多基因系统进行比较研究，单转座子多基因系统应用2A介导多基因串联表达，各基因转录及表达均较稳定。但是在酶活性方面，串联基因靠近前侧的基因活性要高于后方基因。相比之下多转座子多基因系统，各个基因表达水平不够均一，因此需要扩大单克隆细胞筛选的范围。选择代谢酶稳定表达的细胞系进行特异性化合物的肝毒性分析，我们发现与对照组相比，对于生物活性化合物曲格列酮（Troglitazone）和对乙酰氨基酚（Acetaminophen），转基因细胞（HepG/PB3A4.10）的存活率显著低于HepG2野生型细胞。表明细胞株药物肝毒性的敏感性显著提高。.本研究细胞模型的建立将为药物研发过程药物肝毒性的筛选和评估提高更加灵敏的体外细胞模型，加速药物研发的进程，同时降低药物临床肝毒性的风险。