基于人诱导多能干细胞（hiPSCs）的胚胎发育毒性评价模型的建立

Human somatic cells can be induced into pluripotent cells with similarly characterizes of human embryonic stem cells (hESCs), named as human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Researches have indicated that many kinds of human somatic cells can be reprogrammed into hiPSCs by the introduction of specific transcription factors. The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) has accepted the embryonic stem cell test (EST) as a scientifically validated test of embryotoxicity. Compared with hESCs, the source of hiPSCs is more extensive, the somatic cells can be getting from specific persons or specific diseases. Using hiPSCs as a model of safety evaluation can realized personal drug discovery. In this research, we use lentivirus vector pLM-fSV2A and Cre/loxP system to get transgene-free hiPSCs by introduction four transcription factors, OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Through the EST, the differentiation of hiPSCs into neurons, cardiomyocytes, hepatocytes and vascular endothelial cells, we evaluate the embryotoxicity of compounds. Furthermore, we will establish the biomarkers and endpoints for embryotoxicity. Finally, we will use the transgene-free hiPSCs model to evaluate embryotoxicity of unknown compounds.

人诱导多能干细胞（hiPSCs）是将人的体细胞经重编程后获得的具有类似于人胚胎干细胞（hESCs）生物学特性的细胞。研究表明，人多种体细胞经特定转录因子重编程后，均可转变为hiPSCs。2002年欧洲动物实验替代法验证中心（ECVAM）就接受并批准胚胎干细胞试验（EST）用于药物临床前胚胎发育毒性评价。hiPSCs与hESCs相比具有更广泛的细胞来源，可以针对某个人、某种疾病取材，可以实现药物研发及安全性评价的个性化，提高药物研发、药物治疗的针对性。本课题拟利用慢病毒载体pLM-fSV2A及Cre/loxP系统，将转录因子OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC导入人成纤维细胞，诱导筛选得到不含外源基因的hiPSCs。通过对比EST及将hiPSC诱导分化为神经细胞、心肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞，综合评价受试物的发育毒性，建立一套发育毒性评价终点，最终将hiPSC应用于发育毒性评价。

人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）是人体细胞重编程获得的具有与人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hES）相似生物学特性的细胞，具有自我更新及多向分化潜能，在体外可分化为各种类型的体细胞。目前，利用人诱导多能干细胞获得的心肌细胞用于药物引起的心率改变、QT 间期延长和心肌损伤等心脏毒性评价；利用其获得的神经细胞，结合高通量、高内涵技术及电生理学技术，可用于药物引起的神经突出生长异常、电生理改变及神经发育毒性评价；利用人诱导多能干细胞可获得个体特异性的大量肝细胞，具有较高的细胞色素P450 酶活性，能够比较真实的反映人肝细胞的代谢特征，用于评价药物肝细胞毒性；人诱导多能干细胞具有多能性，在体外可分化为外、中和内胚层，具有用于发育毒性评价的可能性；此外，人诱导多能干细胞还可用作3D 培养的种子细胞，构建三维立体组织和器官模型，用于药物早期毒性评价，进一步缩小细胞水平与体内水平评价结果的差异。本研究旨在构建人诱导多能干细胞系并利用hiPSCs模型开展药物靶器官、靶细胞毒性及发育毒性评价。本研究构建了表达OCT4、KLF4、c-MYC、SOX2的慢病毒pLM-OKMS，将人原代皮肤成纤维细胞重编程为人诱导多能干细胞，并将其分化为心肌细胞、神经细胞、肝细胞，将干细胞源的神经细胞（hiPS-derived neurons）应用于神经毒性评价。结果表明：低剂量铅长时间作用可致神经元轴突断裂，凋亡增加；高剂量铅较短时间作用可致神经元胞体空泡变性，凋亡增加；这些结果提示低剂量铅与较高剂量铅可能具有不同的毒性作用方式；该模型能够较准确的反应人体对不同血铅浓度的中毒反应，表明来源于诱导多能干细胞的神经细胞hiPS-derived neurons可用于神经毒性评价。