基于SCR技术的rFN/CDH 富集界面对骨髓MSCs快速粘附和靶向成骨效应及机制研究

选择性细胞滞留技术(SCR)可在术中富集自体骨髓中的有效成骨成分，即刻构建组织工程骨，临床应用前景宽广。如何提高选择性富集的效率是其研究的关键。本课题在前期双嗜性rFN/CDH 融合蛋白构建和功能验证基础上，提出利用层层自组装技术（LbL）制备SCR支架材料的rFN/CDH 仿生纳米富集界面，兼顾生物、理化因素的影响，构建利于种子细胞粘附分化的成骨微环境，提高富集效率。拟通过ELISA、定量PCR、免疫印迹等分子生物学和原子力显微术、X 光电能谱、接触角等生物工程学技术观察纳米自组装界面对间充质干细胞(MSCs)的快速粘附、增殖和成骨分化的影响；并将之试用于改良型骨髓富集器装置，利用骨髓循环过滤的手段，使骨髓MSCs在SCR多孔载体的表面和内部选择性富集；并在细胞基质粘附复合体层面探讨种子细胞在界面快速粘附和成骨分化的机制。本项目的实施可为SCR组织工程骨的研究与开发提供实验依据。

选择性细胞滞留技术(SCR)可在术中富集自体骨髓中的有效成骨成分，即刻构建组织工程骨，临床应用前景宽广。如何提高细胞与支架材料的粘附效率是包括SCR支架材料在内的各种生物活性材料研发的关键。 . 本课题在前期双嗜性rFN/CDH 融合蛋白构建和功能验证基础上，利用层层自组装技术（LbL）制备出SCR支架材料，并根据亲水性变化曲线确定了最佳组装层数，获得DBM-PEI-rFN/CDH -(Chi-rFN/CDH)5富集材料。6-His免疫荧光证实rFN/CDH融合蛋白在DBM内外表面高浓度分布。进一步，采用远超SCR技术流程的操作强度对此材料进行表面修饰稳定性的负载测试，证实LbL技术构建的rFN/CDH富集材料具有良好的稳定性。在体外采用离心细胞粘附实验证实该材料的细胞粘附活性显著高于未经修饰及BSA修饰的DBM。CCK-8等方法证实MSCs在DBM-PEI-rFN/CDH -(Chi-rFN/CDH)5上增殖良好。该材料在SCR技术中对骨髓中单核细胞、幼稚细胞、CD90+/CD105+细胞以及CD34+细胞的富集效率分别为未经修饰DBM组的2.12倍、2.40倍、2.40以及2.28倍，而对有核细胞的富集效率只提高了1.63倍，提示rFN/CDH不仅促进了细胞粘复效率，且对粘附的细胞群体有“选择性”。体内试验采用山羊股骨缺损模型受挫后改用裸鼠肌袋异位成骨实验，植入8周后X线摄影和micro-CT显示，富集骨髓的rFN/CDH 仿生DBM成骨效果明显，其平均骨密度、骨组织容积比、骨小梁厚度等指标均优于未经修饰的DBM。. 本课题按照课题申请书及任务合同书的要求，除大动物体内实验受挫改用小动物体内实验以外，其余研究内容均顺利完成，研究成果发表SCI论著2篇（IF= 3.73、IF=1.05），获实用新型专利2件，培养硕、博士研究生各1名，投稿SCI及CSCD论著各1篇。 . 研究中发现rFN/CDH在整合素-粘附斑激酶-Src-钙黏蛋白-链蛋白信号体系中存在多因素的交互作用，推测抑制PTP1B tyr 152磷酸化可促进链蛋白/钙黏蛋白复合体分离，进而通过α链蛋白-肌动蛋白-细胞骨架途径增强MSCs的粘附活性，课题组后期将在已获批的2014年NSFC面上项目资助下深入其机制研究。