基于LbL技术的rFN/CDH仿生纳米界面对hMSCs的靶向成骨效应及机制

骨种子细胞在支架材料界面的靶向粘附和分化是成骨的关键，目前已有多种基于短肽（如RGD）和多肽（如FNⅢ7-10）的仿生学手段对界面进行改造，但所选择的靶分子作用单一、活性有限，修饰方法对种子细胞种植和靶分子活性均有一定影响，由此严重限制了细胞-界面-骨组织的生物和力学整合。本课题在前期双嗜性rFN/CDH融合蛋白构建和功能验证基础上，提出利用层层自组装技术（LbL）制备rFN/CDH仿生纳米界面，兼顾生物、理化因素对成骨的界面效应，构建利于种子细胞粘附分化的微环境。通过分子生物（ELISA、定量PCR、免疫印迹、MTT、钙结节染色等）和生物工程（原子力显微术、X光电能谱、接触角等）技术观察组装界面对骨种子细胞hMSCs的迁移、粘附、增殖和成骨分化的影响，并在细胞基质粘附复合体层面探讨种子细胞在界面粘附和分化的机制。本项目的实施可为理想组织工程骨和脊柱融合材料的开发提供实验依据。

本课题得到国家自然基金委员会的资助并于2010年在第三军医大学正式立项。现取得了如下结题结果：.1.通过优化的原核表达系统实现了重组蛋白rFN/CDH的高效和活性表达，经分子筛纯化后纯度达95%。.2. 引入LbL技术将rFN/CDH和壳聚糖层层自组装于双相钙磷陶瓷表面，最终组装体为BCP-PEI-rFN/CDH-(CHI-rFN/CDH)5，命名为BCP/LbL/[CHI-rFN/CDH]。.3. 采用界面表征技术以验证检验组装效率，扫描电镜10000倍下未见明显材料微拓扑结构改变；接触角测试显示亲水性明显提高；傅立叶红外能谱分别在3298cm-1处和1657cm-1处检测出特征性-NH2与肽键基团峰。能谱分析发现N元素的显著增加与rFN/CDH吸附有 关；质谱分析建立体外rFN/CDH释放曲线发现BCP/LbL/[CHI-rFN/CDH]组装体具有控释特征。.4.细胞-材料体外相互作用。以hMSCs为种子细胞模型，MTT法发现持续培养3-7天后增殖细胞数量显著高于对照组。离心粗粘附实验显示粘附于自组装表面的细胞量明显高于阴性和阳性对照组。选用RUNX2，ALP，OCN，COL I等成骨标志物行成骨诱导分化检测，Realtime-PCR结果提示RUNX2，ALP，OCN基因表达在成骨诱导培养14天后均有明显上调，免疫印迹法证实OCN蛋白与基因表达具有一致性。免疫荧光法发现α2β1、α5β1和αvβ3型整合素在生长于自组装界面的hMSCs中具有表达差异，而采用特异性拮抗的方法探讨了如上亚型分子在粘附、分化中的作用，发现α5β1、αvβ3对参与了上述过程并发挥了重要作用。. 总体结论：1. LBL技术对蛋白等生物大分子进行材料表面修饰的优势体现在BCP/LbL/[CHI-rFN/CDH]对rFN/CDH的控释效应。2. BCP/LbL/[CHI-rFN/CDH]重组界面优良的生物物理化学表面特征，对种子细胞的高效粘附及成骨诱导分化作用有望赋予其转化意义。3. 机制研究发现α5β1、αvβ3和α2β1在粘附、分化过程中有差异性表达特征。. 本课题相关研究成果发表SCI期刊论著2篇(biomaterials, IF=7.404; Plos One, IF=4.092)，国内核心源期刊1篇（中华骨科杂志），国家发明专利公示2项，培养博士研究生1名