氨基酸受体T1R1/T1R3在奶牛乳腺氨基酸转运与乳蛋白合成中的作用及其机制

Due to the lack of regulation mechanism on dairy cattle milk biosynthesis, it is difficult to regulate milk protein production and milk protein quality accurately. Amino acids can not only function as precursor of milk protein, but also as signal molecules to regulate milk production. Its regulation mechanism remains unclearly. T1R1/T1R3, a G-protein-coupled receptor, has been reported to function as a sensor of amino acids in several tissues. Moreover, we detected functional T1R1/T1R3 in dairy cattle mammary gland recently. Herein, in the present study, we are going to use mammary gland explants and mammary epithelial cells as models, employ gene over-expression, RNAi and antagonistic protein techniques, to investigate response of T1R1/T1R3 to amino acids in mammary gland, study the function of T1R1/T1R3 on amino acid transport and its regulation mechanism, explore the functional mechanisms of T1R1/T1R3 on milk protein biosynthesis through mTORC1 pathway, so that to discover the functional mechanisms of T1R1/T1R3 in dairy cattle mammary gland.

由于对奶牛乳蛋白合成调控的分子机制缺乏了解，生产中对奶牛乳蛋白产量、乳蛋白组成的营养调控受到严重限制。已知氨基酸是乳蛋白合成的前体物并且可作为信号分子参与乳蛋白合成调控，但其详细调控机制不清。G蛋白偶联受体T1R1/T1R3已被证明在多种组织中参与氨基酸的直接感知，并且本课题组的前期结果初步显示乳腺组织中存在功能性的T1R1/T1R3。因此，本研究拟从体内和离体两个层面，以奶牛乳腺外植体和奶牛乳腺上皮细胞系作为模型，利用基因超表达和RNA干扰技术，结合蛋白质活性特异性阻断技术，分析乳腺T1R1/T1R3的氨基酸感知能力，探讨T1R1/T1R3对奶牛乳腺必需氨基酸转运的调控及其分子机制，揭示T1R1/T1R3通过mTORC1信号通路调控乳蛋白合成的机制，从而搞清乳腺T1R1/T1R3的功能及其作用机制。研究结果可为奶牛乳蛋白产量、乳蛋白组成的营养调控及奶牛品种的分子设计提供新的理论依据。

本研究发现G 蛋白偶联受体T1R1直接感知细胞外氨基酸水平，进一步通过细胞内mTOR信号通路参与乳蛋白合成调控。首先，以乳腺上皮细胞系（HC11）作为模型来进行研究发现，在完全培养液和去除EAA的培养液中siRNA沉默T1R1后乳腺上皮细胞中的β-酪蛋白的含量均显著下调，且去除EAA的HC11细胞中β-酪蛋白的含量较完全培养液组下调了1倍。已知mTOR信号通路是乳蛋白合成的关键信号通路，沉默HC11细胞中的T1R1，mTOR信号通路的活性被显著抑制，表明T1R1通过mTOR信号通路参与乳蛋白合成调控。沉默T1R1后mTOR信号通路的活性被抑制，而氨基酸转运蛋白的表达量又显著上调。结合关键氨基酸转运蛋白SLC1A5抑制剂GPNA和SLC3A2/SLC7A5抑制剂BCH，比较对照组细胞和沉默T1R1细胞的细胞裂解产物中氨基酸的浓度，进一步确认T1R1是通过直接感知细胞外氨基酸发挥调控功能。为进一步证实这一结果，我们采用了T1R1基因敲除小鼠。通过差重法测定了泌乳第6d T1R1敲除小鼠与野生型小鼠的泌乳量。结果表明，敲除T1R1后小鼠泌乳量相比较野生型小鼠下降了24.3%，敲除T1R1相比较野生型小鼠，β-酪蛋白的蛋白水平下调76.1%，β-酪蛋白的mRNA水平下调42.4 %。敲除T1R1小鼠其乳腺mTOR下游底物4EBP1和S6K的磷酸化水平被显著抑制，且S6K的底物S6的磷酸化水平也出现降低。对乳腺外植体体外培养处理，所得结果与前述细胞系结果吻合。此外，本课题探讨了乳腺环状RNA表达特征及部分环状RNA的功能。本项目共发表10篇论文，其中SCI论文7篇（中科院2区以上5篇），培养硕士研究生5名，1篇硕士学位论文被评为江苏省优秀硕士学位论文。