黄牛T1R1和T1R3基因功能及其调控机制研究

搞清氨基酸采食与消化吸收的调控机制有利于确定反刍动物氨基酸营养需要，促进其生产潜力的充分发挥。人和模式动物T1R1和T1R3在蛋白质（氨基酸）采食、吸收中发挥重要调控作用，但是其具体的作用机制尚不清楚，家畜相关研究未见报道。申请人前期研究初步显示，牛T1R1和T1R3可能参与氨基酸的识别与吸收调控。本项目拟以牛为对象，从组织表达与细胞定位、T1R1/T1R3共转染细胞测试、基因功能性变异的表型效应分析等方面系统研究T1R1和T1R3的功能。采用基因超表达和RNA干扰技术，分析L-氨基酸对T1R1/T1R3信号转导关键蛋白表达的影响，搞清这种影响对CCK、GLP-1和GIP的调控作用，初步揭示T1R1和T1R3对氨基酸采食和吸收的调控机制。项目的实施将有助于揭示氨基酸的吸收和体内氨基酸平衡调控的分子机制，为确定牛氨基酸需要量，提高蛋白质饲料利用率，培育高效优质肉牛新品种提供理论依据。

本项目采用黄牛作为研究对象，从组织表达与细胞定位、体外表达、功能性变异的表型效应分析等方面系统研究了T1R1和T1R3的功能，并探讨其作用机制。已圆满完成合同各项技术指标和任务，部分内容已超额完成。取得的主要成果如下：.1. 证实了牛T1R1/T1R3的氨基酸识别功能，并发现它与人和其他动物不完全相同，进一步揭示了T1R1/T1R3进化上的相对保守性，和物种间的差异性；.2. 完成了黄牛T1R1基因的多态性分析，共得到9个SNP（ EX3-4491G>C、EX3-4522G>A、IVS3-4593C>T、EX4-5081C>T、EX4-5096C>T、EX4-5110C>A、EX5-5517G>A、EX5-5610A>G、IVS5-5624G>A），7个位于外显子上，其中4个引起了氨基酸的变异（405G>R、415G>Q、462T>N、530K>R）。这些变异位点与黄牛的体尺、体重存在相关，其中462T>N变异位点BB型个体体重大于BC和CC型，效应值大于5%；.3. 揭示了黄牛T1R3基因的遗传变异，共检测到4处位于外显子的SNP（ EX3-776 C>T、EX3-806 G>A和 EX-2663T>C），前两个SNP引起了氨基酸改变（200R>W、210V>M）。 EX-2663T>C位点野生型个体体重显著大于突变型，效应值大于5%；.4. 检测到牛消化道瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠以及胰腺等11个组织均有T1R1、T1R3表达，并确定空肠表达量最高；.5. 发现T1R1和T1R3共表达于肠绒毛中，进一步分析发现它们主要分布于小肠内分泌细胞。 T1R1和CCK位于内分泌细胞的不同细胞区域，T1R1靠近肠腔一侧，而CCK位于基底侧，说明肠腔侧的氨基酸信号可能通过T1R1参与CCK分泌的调控；.6. 本项目研究在国内外学术期刊共发表论文7篇，其中SCI论文6篇；申请国家专利2项，获批国家专利2项；培养硕士研究生6名。部分研究结果已经在合作企业推广实践，效果良好。