奶牛乳腺CSN1S1基因环状RNA的功能及其作用机制研究

Circular RNA acts as miRNA sponge to regulate gene expression. We found that a CSN1S1 derived circular RNA (cCSN1S1) was the highest expressed among cattle mammary gland circular RNAs. cCSN1S1 was conserved among mammal animals, varied depending on lactation stages. Both CSN1S1 mRNA and cCSN1S1 have putative miR-204 target sites, which indicated that cCSN1S1 can regulate the synthesis of αs1-casein through competitive binding to miR-204. We aim to investigate the function of cCSN1S1 and miR-204 on αs1-casein biosynthesis through gene knockdown and overexpression, and to discover the regulation mechanism through dual luciferase reporter gene assay and RNA pull down. The final objective is to discover the novel mechanism of αs1-casein biosynthesis regulation, and to provide the guide for improvement of milk protein production, and to improve the theory of regulatory circular RNA.

新近研究发现环状RNA可通过吸附miRNAs参与基因表达调控。我们前期研究发现，一个由αs1-酪蛋白基因（CSN1S1）表达的环状RNA（cCSN1S1），是奶牛乳腺中表达量最高的环状RNA。它在泌乳动物乳腺中均高表达，且其表达量随泌乳期波动。生物信息学分析表明miR-204在CSN1S1 mRNA和cCSN1S1这两种RNA中均有多个高可信度的结合位点，这表明cCSN1S1可能通过吸附miR-204调控αs1-酪蛋白的合成。本项目拟通过RNA干扰和基因过表达技术相结合研究cCSN1S1和miR-204对αs1-酪蛋白合成的调控作用，并通过双荧光素酶报告基因法和RNA pull down技术深入探讨其作用机制。以期深入揭示乳蛋白合成调控机制，为奶牛分子育种和精准营养调控提供理论指导，并完善环状RNA调控理论。

本项目主要探讨了乳腺细胞中CSN1S1环状RNA的功能及其作用机制。经生物信息学分析，CSN1S1环状RNA含有miR-204-5p的吸附靶点，可能通过吸附miR-204-5p参与乳腺上皮细胞合成调控。因此从探究miR-204-5p在不同组织表达规律入手，进一步探究其在乳腺上皮细胞合成乳脂和乳蛋白过程中的作用，初步阐述miR-204-5p及其靶基因调控乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成的机制，为提高乳用动物乳汁中乳脂和乳蛋白的含量提供依据。结果表明，miR-204-5p在哺乳期乳腺中表达量显著高于乳腺中的表达量，说明miR-204-5p可能参与了泌乳过程。通过mimics和inhibitor证明miR-204-5p促进乳腺上皮细胞β-酪蛋白的合成。进一步分析发现miR-204-5p可通过影响脂质合成关键基因表达，促进乳腺上皮细胞脂类合成。miR-204-5p是通过靶向Sirt-1实现对对其下游脂质合成相关基因表达的调控，从而影响甘油三酯的合成。进一步根据miR-204-5p合成Antagomir和Agomir，直接注射至妊娠后期乳腺，在活体水平进一步验证了前述结果。结合有关研究报道，进一步确认CSN1S1环状RNA可能通过吸附miR-204-5p抑制乳腺上皮细胞蛋白和脂类合成调控。为探究CSN1S1环状RNA（包含CSN1S1基因12~16号外显子序列）是否具有翻译能力，构建了其过表达载体。使用引物PCR扩增CSN1S1基因12~16号外显子片段，利用翻译报告载体pEGFP-Hsp70构建CSN1S1-12~16片段过表达质粒。将重组质粒pEGFP-CSN1S1-12~16转至293T细胞，细胞培养48h后观察发现有绿色荧光蛋白产生，说明CSN1S1环状RNA具有翻译潜能，具体有待进一步验证。