沙葱黄酮类化合物对肉羊免疫机能的影响及其机理研究

In previous research project supported by NSFC, it is found that the Allium Mongolicum Regel(AMR) and its extractives can significantily improve the immunity and antioxidant function in meat sheep, and also confirmed that the flavonoids are one group of important active compounds in the fat-soluble extract of AMR. In order to take full advantage of AMR resources, and furtherly reveal the immune active ingredient, and its mechanism of function in AMR, this project conducted to isolate the flavonoids from fat-soluble extracts in AMR, to determine the optimum process of separation, purification and identification of flavonoids, to study the effect of flavonoids on immunity and antioxidant function of meat sheep by in vitro and in vivo systematically, and by adopting advanced technology and instrument of animal nutrition, biochemistry, molecular biology, cell culture, flow type cytometry, RT-PCR, ELISA, two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry, study on the impact of flavonoids on cell cycle and signal transduction pathway of lymphocyte and related gene expression of immune cell in meat sheep, to explore the immune mechanism of flavonoids from the molecular level. The result of project will provide not only a new idea for further processing of AMR products, but also a scientific basis for the artificial synthesis and exploitation of new, and natural immune enhancer and/or feed additive. Therefore, the project has an important theoretical significance and widely application prospect in meat sheep husbandry.

在前一个国家基金项目的研究中发现，沙葱及其提取物能够显著提高舍饲肉羊的免疫机能和抗氧化能力，并已确定黄酮类化合物是沙葱脂溶性提取物的重要活性成分。为了充分利用沙葱资源，进一步揭示沙葱的免疫活性成分及作用机理，该项目欲从沙葱脂溶性提取物中分离出黄酮类化合物，建立沙葱黄酮类化合物提取纯化鉴定的最佳工艺，通过体外和体内试验对沙葱黄酮类化合物的免疫抗氧化作用进行系统研究；采用动物营养学、生物化学、分子生物学、细胞培养、流式细胞仪、RT-PCR、酶联免疫、双向电泳、质谱等技术和手段深入研究沙葱黄酮类化合物对淋巴细胞的细胞周期及信号转导途径和免疫细胞相关基因表达的影响，从分子水平上探究沙葱黄酮类化合物的免疫抗氧化作用机制。该研究将为沙葱产品的深加工提供新的思路，也为以后合成、开发新的天然的免疫增强剂或饲料添加剂提供科学依据，所以，该研究对肉羊养殖业具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

本项目首先在单因素试验基础上，通过Box-Behnken试验设计，优化了超声波辅助提取沙葱黄酮的最佳提取工艺参数为：提取时间为15min，提取温度为40℃，乙醇浓度为75%，料液比为1:30，沙葱黄酮得率为12.85mg/g。经液质联用仪、紫外分析、红外分析、核磁共振等方法检测后发现，沙葱黄酮类化合物的主要组成成分为3',4'-环氧基-7-O-5-甲氧基黄酮醇、7-O-5,4'-二甲氧基-3'-羟基黄酮、芦丁、木犀草素-5’-O-葡萄糖-4-羟基苯丙酸、异槲皮苷金合欢素等物质。通过体外试验研究发现沙葱黄酮具有较强的抗氧化活性及抗菌活性。动物饲养试验结果显示，舍饲肉羊日粮中添加沙葱黄酮类化合物后可显著提高其血清及肝脏中T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-PX活力(P0.05)，显著提高其ACP、LZM、NO等非特异性免疫指标(P0.05)；对细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量有显著上调作用(P0.05)，同时上调CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值，下调CD8+细胞数量；对肉羊血清生长激素（GH）、类胰岛素样生长因子-I（IGF-I）含量有显著提高的作用（P<0.05）；对肉羊机体体液免疫和细胞免疫功能具有重要的调节作用。通过细胞、分子及蛋白水平进行相关机理的研究结果显示，舍饲肉羊日粮中添加11 mg/kg～33 mg/kg沙葱黄酮类化合物对其免疫相关基因及蛋白均具有良好的调节作用，其中日粮添加33mg/kg沙葱黄酮类化合物对肉羊淋巴细胞转化率及细胞凋亡有显著的提高作用(P0.05)，并上调IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、STAT1基因mRNA的表达水平。经过体外和体内试验的筛选确定了在舍饲肉羊日粮中添加11mg/kg～33mg/kg沙葱黄酮类化合物可显著提高其机体整体免疫机能、抗氧化能力和生长性能。所以，该项目的研究为以后开发以沙葱黄酮类类化合物为主要成分的舍饲肉羊饲料添加剂提供了科学依据，故研究成果具有良好的应用前景。