甲减仔鼠脑发育过程中miRNA的异常表达及其分子机制的研究

甲状腺激素在脑发育中具有重要的作用，临床上发现胎儿先天性甲减或妊娠期母体甲状腺激素不足，会不同程度地影响后代神经智力发育。为了深入解析胎儿期/婴幼儿期甲状腺激素对脑发育过程的精细调控作用，本课题将在建立甲减大鼠动物模型的基础上，应用快速有效的miRNA芯片技术，比照正常大鼠，检测甲减大鼠的胎/仔鼠大脑皮质及海马内miRNA的表达图谱，应用原位杂交技术检测miRNA，以确定甲状腺激素缺乏对胎/仔鼠大脑皮质和海马中miRNA的时空表达谱，并进一步寻找异常表达的miRNA的靶基因。本研究还将应用左甲状腺素（L-T4）在不同时间干预治疗甲减仔鼠，通过检测标志性miRNA的表达变化，在早于mRNA基因表达调控阶段，更精细地确定L-T4干预治疗的最佳时间。本研究将为预防和治疗甲减导致的脑发育障碍提供理论依据，对减少出生缺陷、提高全民素质具有现实意义。

为探讨甲减孕鼠的胎鼠/仔鼠脑发育过程中miRNA的异常表达及其分子机制，72只SPF级雌性Wistar大鼠随机分成：正常对照组（n=24）与手术完全切除甲状腺的甲减组（n=48）。选取造模成功的雌鼠与正常的雄鼠合笼交配，于妊娠13天（E13）及妊娠17天（E17）以及仔鼠出生当日（P0）及出生后7天（P7）分别取胎/仔鼠脑组织。每一时间点选取2只母鼠的胎/仔鼠采用美国Affymetrix芯片进行miRNA检测。选取E13甲减组胎鼠脑组织增高的mir-206进行验证。RtPCR检测E13胎鼠脑组织中mir-206的靶基因之一BDNF 的mRNA表达量，Western blot方法检测BDNF 蛋白表达量，并与同日龄对照组比较。构建包含mir-206与其靶基因—BDNF相结合的3个作用位点，构建荧光素酶报告基因pMIR-REPORT-BDNF，与pre-mir-206同时转染人胚肾细胞（HEK）293细胞，测定荧光素酶活性观察mir-206对外源性靶基因的抑制作用。.结果显示：1．筛查出母鼠甲减组的胎/仔鼠脑组织在E13、P7皮层和P7海马组增高2倍以上的miRNA谱，以及母鼠甲减组的胎/仔鼠脑组织降低50%以上的miRNA谱。.2．mir-206在甲减组E13胚胎脑组织中表达明显增多。3．E13胎鼠脑组织中BDNF的mRNA水平，甲减组与正常对照组相比差异不显著（P>0.05）；而Westernblot测定E13胎鼠脑组织的BDNF前体及成熟的BDNF蛋白水平均明显低于正常对照组（P<0.05）。4．pMIR-REPORT-BDNF与mir-206共转染HEK293细胞后，与pMIR-REPORT-BDNF及NC共转染相比，以及与单独转染pMIR-REPORT相比，荧光素酶的相对活性均明显下降（P<0.05）。结论：研究调查了母鼠甲减所致胎/仔鼠脑发育中miRNA的差异表达谱。mir-206在母鼠甲减组的胎鼠E13脑组织中表达明显增多。mir-206与BDNF 的蛋白水平呈负相关，提示mir-206介导的BDNF 水平下降参与了甲减所致妊娠早期后代的脑发育障碍。