血红素氧化酶独特的ND9/14位点促进空肠弯曲菌感染定植及机制研究

Iron acquisition is essential for survival, persistence, infection and colonization. Host within 95% of the iron in the form of heme, bacteria can decompose hemoglobin or heme to get Fe.C. jejuni tend to use heme as the sole iron source. Prophase work found that the only heme oxygenase ChuZ in C.jejuni with a unique N-Domain binding site on the surface (ND9/14 loci), and its unique structure and biochemical experimental data suggest that ND9/14 loci enhance the ability of C.jejuni to growth，to clarify its mechanism of action, we intends to research the ND9/14 sites, use the knockout technology to construct the ND9/14 loci mutant strains, compare the wild strain and the mutant strains on the utilization of the heme enzyme activity and the growth ability, through the C.jejuni infection animal model to invest-tigate the ND9/14 loci in colonization role; By RT-PCR, westenblot, HPLC, LC, MS etc method to detection of gene expression and enzyme activity in several important metabolic pathways. Help understand the relationship between structure and function, in order to further study the C.jejuni infection mechanism .

铁是细菌生存、定植感染所必须的一种微量元素，参与多种催化反应关键酶的重要金属辅助离子。宿主内95%的铁都是以血红素铁的形式存在，细菌只能通过对血红素的分解获取铁。空肠弯曲菌快速定植和铁代谢密切相关。前期工作发现空肠弯曲菌的唯一血红素氧化酶ChuZ具有独特的血红素N-Domain二体界面结合位点（ND9/14位点）并能增强酶的活性，结合细菌特性显示：ND9/14位点可能具有增强空肠弯曲菌生长定植的能力。为阐明其作用机制，本项目拟以ND9/14位点为主要研究对象，采用基因敲除回补技术构建ND9/14位点突变株，比较野生株和突变株对血红素的利用情况，观察其在小鼠体内感染定植能力；通过RT-PCR、westenblot、HPLC、LC-MC等方法检测野生株和突变株在铁调控的重要代谢通路中关键酶的表达和降解产物，为探讨ChuZ、ND9/14位点调控细菌定植机制奠定基础。

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni) 属革兰阴性微需氧菌，感染后可引起急性胃肠炎、胆囊炎、脑膜炎、菌血症等，最严重的并发症为Guillain-Barré和Miller-Fischer综合症。近年来已超过大肠杆菌、沙门氏菌，成为导致急性腹泻最常见的病原菌，甚至导致感染者死亡，已成为严重的公共卫生问题。炎性小体（inflammasome）是在细胞质中的通过感知入侵细胞的细菌，病毒或细胞损伤碎片而形成的一种多蛋白复合体。炎性小体通常包含多种传感蛋白如Nod-like receptors （NLRs）、 Pyrin HIN200 domain (PYHIN)和效应蛋白酶procaspases (主要是 caspase-1)。炎性小体聚集后能够介导caspase-1的激活而随后激活IL-1β和IL-18细胞因子，而诱导一种被称焦亡的细胞死亡方式。空肠弯曲菌感染能够诱导急性的胃肠炎性反应，而细胞的感染伴随着分泌多种促炎细胞因子，包括IL-6、TNF-α和IL-1β。IL-1β在空肠弯曲菌感染后临床表现中的潜在重要作用。探究空肠弯曲菌血红素氧化酶ChuZ对巨噬细胞炎性小体激活的影响 .重要结果 与对照组相比，WT C. jejuni，△ChuZ C. Jejuni均能显著促进BMM IL-1β、NLRP3、procaspase-1、caspase-1的表达（P<0.01）；△ChuZ C. Jejuni组与WT C. Jejuni组相比，IL-1β、NLRP3、procaspase-1、caspase-1的表达显著降低（P<0.01）。与WT BMM 组相比，WT C. jejuni，△ChuZ C. Jejuni分别刺激NLRP3-/- BMM后，IL-1β表达均显著降低（P<0.01）。同时，与control 组相比，WT C. jejuni，△ChuZ C. Jejuni刺激+ MCC950组后，IL-1β表达均也显著降低（P<0.01）。.结论 空肠弯曲菌血红素氧化酶ChuZ与巨噬细胞中NLRP3/ASC/caspase-1炎性小体的激活程度相关，并促进巨噬细胞中IL-1β的表达，参与了空肠弯曲菌对宿主的炎性作用。