核仁蛋白NPM1参与PEDV N蛋白核仁定位及病毒复制的分子机制

The porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV), a member of the Coronaviridae family, causes acute diarrhiea and dehydration and with mortality 100% in suckling pigs. The interaction between viruses and the nucleolus is a pan-virus phenomenon, whereas DNA viruses and retroviruses that interact with the nucleolus replicate in the nucleus where the nucleolus is immediately accessible, why RNA viruses, particularly positivestrand RNA viruses, interact with the nucleolus when the site of viral-genome replication is in the cytoplasm is less intuitive. This spatial and temporal differences lead to a more complex mechanism that RNA viruses interact with the nucleolus to recruit nucleolar proteins and usurp host-cell functions to facilitate virus replication. NPM1 protein is an important nucleolar phosphoprotein with pleiotropic functions and through interaction with host and viral proteins to involved in various cellular processes and viral replication, preliminary studies have shown PEDV N protein localization to the nucleolus and interaction with NPM1. Hence, we use PEDV N protein and NPM1 protein of host cell as this object of study, utilize Co-immunoprecipitation, 3D Live Cell Imaging, RNA interference and other methods, to reveal whether their interactions mediated PEDV N protein nucleolar localization and how NPM1 protein regulation PEDV replication, ultimately clarify the molecular mechanisms of NPM1 protein involved PEDV N protein nucleolar localization and viral replication, to provide new theoretical basis for understanding the interactions between coronavirus N protein and nucleolus as well as the replication mechanism of coronavirus.

PEDV是引起幼龄仔猪水样腹泻且导致100%死亡的一种重要的冠状病毒。病毒与核仁之间的相互作用是一种泛病毒现象，不同于DNA病毒在细胞核内完成复制，RNA病毒在胞浆内复制，这种时空差异导致RNA病毒如何招募宿主细胞中的核仁蛋白并劫持宿主细胞的功能来促进病毒复制的机制更为复杂。NPM1蛋白是宿主一种重要的核仁蛋白，通过和生物体内以及病毒蛋白互作进而参与生物体的生物学过程和病毒的复制过程，前期研究证明PEDV N蛋白定位到核仁并与NPM1相互作用。因此本研究以PEDV N蛋白和NPM1蛋白为研究对象，采用免疫共沉淀、3D活细胞激光共聚焦分析成像技术、RNA干扰等方法，揭示其互作是否介导PEDV N蛋白的核仁定位以及NPM1蛋白如何调控PEDV的复制，最终阐明NPM1蛋白参与PEDV N蛋白核仁定位及病毒复制的分子机制，为理解冠状病毒N蛋白与核仁之间的相互作用及病毒致病分子机制提供新的理

一般来说病毒感染后，宿主对病毒侵染最初的应答是天然免疫应答，如细胞凋亡、炎性反应和抗病毒免疫分子分泌等，通过这些免疫机制，宿主可以拮抗病毒的入侵，或者为宿主建立获得性免疫应答赢得时间从而最终清除入侵的病毒。但是，很多病毒在长期进化的过程中获得了避免细胞过早凋亡和抑制炎症反应的能力，从而得以在宿主体内大量增殖，最终导致疾病的发生。.PED是由套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirinae）α-冠状病毒属（Alphacoronavirus）的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，该病是猪的一种急性、高度接触传染性的肠道疾病，以严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征，各种日龄的猪均易感，尤其是哺育仔猪，发病率有时高达100%，死亡率为30~80%。因此，开展PEDV复制机制相关的基础研究具有重要性，在解析冠状病毒的复制机制方面更有普遍的借鉴意义。.本研究在对PEDV N蛋白核定位特性研究的基础上，进一步利用免疫共沉淀和GST-pull down试验发现并证实PEDV N蛋白和NPM1蛋白存在相互作用，并通过激光共聚焦试验发现，N蛋白和NPM1蛋白共定位于细胞的核仁中。随后通过GST-pull down方法对两者相互作用结构域进一步鉴定，发现N蛋白aa147-294与NPM1蛋白的aa189-294是两者相互作用的必需区域，并且NPM1蛋白的K263R突变可以促进N和NPM1的相互作用。在探索NPM1蛋白在N蛋白核仁定位的作用中发现N蛋白的核仁定位并不依赖NPM1蛋白的核质穿梭功能。在研究NPM1蛋白对病毒复制的作用中发现，在PEDV感染的细胞中NPM1蛋白的表达显著上调。同时发现过表达NPM1蛋白时，可促进N蛋白的表达和PEDV的增殖；相反，利用靶向NPM1蛋白的特异性干扰小RNA分子沉默PEDV易感细胞内源性NPM1蛋白的表达，N蛋白的表达和PEDV的增殖均受到抑制。进一步对其分子机制研究发现N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其免于被切割，上调细胞的抗凋亡能力，避免细胞过早凋亡，进而促进病毒的复制。