猪流行性腹泻病毒N蛋白核定位特性及其对宿主细胞周期影响

病毒和核仁之间的作用是一种泛病毒现象，DNA病毒、逆转录病毒和RNA病毒均能和核仁相互作用。由于RNA病毒（尤其是正链RNA 病毒）是在细胞质中复制，它们和核仁之间的相互作用不如在细胞核中复制的DNA病毒和逆转录病毒直观。对正链RNA病毒而言，由于病毒蛋白参与RNA合成和衣壳化等，所以病毒蛋白进、出核仁对病毒复制至关重要；研究表明经典RNA病毒和核仁之间作用能够促进病毒的复制。本研究以冠状病毒PEDV N蛋白为研究对象，利用活细胞成像技术，荧光共聚焦显微技术，缺失突变技术，漂白后荧光恢复技术，漂白后荧光消失技术和流式细胞术等来鉴定其核仁定位信号和核输出信号，分析N蛋白的核定位特性、核输出机制及其与核仁蛋白之间的作用。旨在揭示PEDV N蛋白核定位特性及其与宿主细胞核仁蛋白之间的作用对宿主细胞周期和病毒复制的影响；同时为新型抗PEDV病毒治疗，如重组疫苗、治疗性分子干预提供理论和技术支持。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性高度接触性肠道传染病，以严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征，并呈世界范围流行，该病的传播和流行给养猪业造成了严重的经济损失。冠状病毒的N蛋白作为一种在感染的细胞中产生量最多的病毒蛋白之一，其在调节病毒复制和改变宿主细胞进程方面具有关键的作用。本研究首先利用生物信息学在线软件对N蛋白进行了亚细胞定位信号的预测，然后结合冠状病毒N蛋白氨基酸序列特点，对N蛋白进行截短并构建相应的重组质粒，利用激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位的特征。结果表明核仁定位信号初步定位于NR1区的71SNWHFYYLGTGPHGDLRYRT90，NR2确定了一个NES基序，定位于222LVAAVKDALKSLGI235，并在NR3区也初步确定了一个核输出信号，位于325LAPNVAALLFGGNVAVRELADSYEITYNYKMTVPKSDPNV364，为精确鉴定功能性的亚细胞定位信号奠定了坚实的基础。在研究PEDV N蛋白对细胞周期影响中发现Vero E6感染PEDV 12h后可引起细胞在G2/M期停滞的现象，并且感染G2/M期细胞有利于病毒的复制，而且发现感染细胞中的p21含量上升，p53含量上升，CyclinA含量下降，CyclinD含量上升，CyclinB含量下降，表明病毒感染细胞可以进一步影响其细胞因子的变化。进一步研究发现与完整的N蛋白相比，缺失核仁定位信号的Ｎ蛋白不能定位于细胞核仁，同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力，从而揭示了N蛋白核仁定位信号对细胞周期具有重要的作用。在对PEDV N蛋白核定位特性研究的基础上，进一步利用免疫共沉淀和GST-pull down试验发现并证实PEDV N蛋白和NPM1蛋白存在相互作用，并通过激光共聚焦试验发现，N蛋白和NPM1蛋白共定位于细胞的核仁中。随后通过GST-pull down方法对两者相互作用结构域进一步鉴定，发现N蛋白aa147-294与NPM1蛋白的aa189-294是两者相互作用的必需区域，进一步研究发现N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其免于被切割，上调细胞的抗凋亡能力。对PEDV N蛋白开展亚细胞定位特征的研究及其在病毒复制过程中的作用，有助于了解PEDV的致病机制，并为基因工程疫苗的研究和抗病毒策略提供依据。