基于内源性化学小分子NO、CO的信号转导分子机制研究

生命体中内源性化学小分子NO、CO、H2S作为信号转导分子在血液循环系统和神经系统中有非常重要的生理功能。基于化学小分子的信号转导分子机制及其与疾病诊治和创新药物的研究是化学生物学和生物医学领域的一个前沿热点。本项目拟在分子、细胞两个层次上研究NO/CO信号转导的分子机制和调控机制。通过用化学小分子探针（内源性,NO/CO; 外源性,可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激活剂/激动剂）对NO信号转导的调控研究，揭示NO信号转导的分子机制和调控机制。通过研究在NO信号转导过程中关键血红素金属酶的结构-性质-反应-功能的关系，阐明金属酶sGC的结构改变/基因突变对其信号转导的调控机制。通过研究NO和CO两个信号转导通路之间的相互对话和作用机制，明确NO/CO信号转导网络的调控机制。探索NO信号转导障碍/紊乱导致疾病的分子机制，为NO信号转导相关疾病的防治和创新高效心血管病药物的开发提供依据和思路。

1998 年，美国的三位科学家（Furchgott RF, Ignarro LJ 和Murad F）因发现“NO 是心血管系统中一种重要的信号转导分子”而荣获了诺贝尔生理和医学奖。至此以后，NO 信号转导越发受到人们的密切关注。本项目的研究内容包括以下几个方面。首先我们成功建立了一套 hsGC 蛋白的高效表达与纯化体系。我们成功构建并表达纯化了β1，α1 和α2 亚基相关蛋白以及 β1-α1 和 β1-α2 血红素结构域的连接体蛋白。EPR 谱证实 α 和 β1 两个亚基在结合血红素的微环境上最大的区别在于β1 亚基有一个近端轴向配体（His105）配位而 α 亚基缺乏强的轴向配体。血红素转移及 ANS 外源荧光实验表明 α 可能是通过强的疏水相互作用稳定结合血红素的。在异源二聚 sGC （hsGCβ1-α1，hsGCβ1-α2）蛋白中，α 和β1 亚基的 N-端血红素结构域共同参与了血红素的结合，但其序列中的His105 并没有与血红素轴向配位。变温圆二色光谱结果表明 hsGCβ195 蛋白具有较好的热稳定性。pH滴定实验结果说明hsGCβ195 蛋白具有较好的碱稳定性。圆二色光谱及Trp22 内源荧光光谱结果都表明 hsGCβ195-α259 蛋白与单个亚基相比发生了很大的构象变化，并具有很好的稳定性。我们进而研究了 hsGC 和 CO/NO 结合过程,提出了一个可能的 CO/NO 结合模型。我们CO 滴定的结果显示YC-1 对CO 结合没有影响，等温滴定量热（ITC）测定结果也表明YC-1 与hsGCα259 并没有强的相互作用。我们还构建了hsGCβ195H105G 突变体蛋白并进行详细的性质表征。我们成功培养出了 hsGCβ195-α259 和 hsGCβ195H105G-α259 突变体的脱辅基及含血红素形式蛋白的多种晶体，并已经获得晶体衍射数据，结构的解析工作正在进行中。我们通过检测产物二级信号分子cGMP 的浓度分别研究了sGC 及其突变体金属酶的活性；研究化学小分子（激动剂/激活剂）对sGC介导NO/CO信号转导的调控，阐明了这一信号网络的分子机制和调控机制。我们通过UV-vis，EPR, 亚硝酸还原酶活性检测以及分子动力学模型等实验证实只有还原态同源二聚的sGC 具有亚硝酸还原酶的功能，并且可能在体内行使着自激活的过程。