细胞内金属锰离子转运、调控蛋白的结构基础及其作用分子机制研究

As one of the most exciting and rapidly expending research fields in recent years, the field of cellular metal homeostasis has been a hot focus area in inorganic biological chemistry and chemical biology when it became clear that metal availability directly regulates at the transcriptional level genes involved in metal ion resistance. Cells tightly regulate metal accumulation, transportation, distribution. Metal ions play key roles in most biological processes by allowing proteins virtually unlimited catalytic potential and have a great impact on protein stability. The variation of proteins for metal homeostasis in expression, distribution, structure, and function is the key point to understand the mechanism of pathology such as progressive neurodegrative disorder. This proposal will focus on cellular manganese homeostasis regulation. Mn transporters (SMF1, SMF2, MTM1), Mn regulator (TrOR), functional enzyme MnSOD, and their mutants will be prepared and characterized by protein crystallography, UV-Vis, EXAFS, EPR, Stopped-flow, et al. Structure, function and mechanism of these Mn proteins will be investigated. The regulation mechanism of cellular Mn homeostasis will be explored. The relationship between structural and functional variation of these Mn proteins and Mn metabolism diseases will be addressed to understand the pathological mechanism of Mn metabolism. The results will provide valuable information for new drug designs and treatment strategies of Mn metabolism diseases.

金属离子在生命体细胞内的转运、代谢、内稳态平衡及其相关疾病的研究是无机生物化学、化学生物学和生物医学等研究领域的一个前沿热点。金属转运、代谢平衡调控蛋白的表达、定位、结构、功能的变化常常成为某些金属代谢疾病的关键病理环节。本项目拟以金属锰离子为研究对象，运用分子生物学和蛋白质化学技术，制备锰转运蛋白、功能MnSOD酶和锰调控蛋白及其它们的突变体蛋白; 利用蛋白质晶体学、UV-Vis、EXAFS、EPR、Stopped-flow等生物物理方法分别研究它们的金属中心结构和蛋白质结构；研究这些锰蛋白的结构、性质、功能及其与锰离子的相互作用机制。该课题旨在阐明锰在细胞内转运、代谢、稳态平衡的分子机制和调控机制，揭示锰转运和调控蛋白的功能变化与锰金属中心环境基因突变的关系，发现锰代谢疾病与锰转运、代谢过程中关键基因突变的关联，为阐明与锰代谢相关的病理机制，为锰代谢疾病的防治和药物设计提供依据及思路。

金属离子在生命体细胞内的转运、代谢、内稳态平衡及其相关疾病的研究是无机生物化学、化学生物学和生物医学等研究领域的一个前沿热点。金属转运、代谢平衡调控蛋白的表达、定位、结构、功能的变化常常成为某些金属代谢疾病的关键病理环节。本项目以金属锰离子为研究对象，首次克隆表达了MnSODcd，解析了它的晶体结构，测定了其SOD 酶活性，利用蛋白质虚拟对接计算和等温量热滴定的方法探索了2-甲氧基雌二醇（2-ME）对MnSODcd 酶活的抑制，发现 2-ME 可以结合在MnSODcd 的二聚界面上（解离常数为~8.6 μM），从而干扰两个MnSODcd 单体金属中心之间的联系，达到抑制其活性的效果。我们同时发现SODcd 的金属中心可被多种金属离子占据，但是只有Mn 和Fe 离子是活性金属，Co、Cu、Ni 离子替代Mn 的SODcd 没有SOD活性。该SODcd 表现出显著的金属特异性，结合错误的金属会导致活性降低或失活。我们研究了SODcd 金属特异性的分子机制，金属的内在属性（d电子构型，配位化学）和SODcd 精细的氢键网络共同决定了 SODcd 的金属特异性,这与该酶的活性密切相关。通过定点突变研究，我们发现TroR 第 11 位天冬酰胺残基对其金属结合和构象变化有重要的影响。EMSA，荧光各向异性以及ITC 实验结果表明只有在Mn2+ 存在下，TroR 才能结合 troABCD 启动子 DNA，并建立了TroR结合DNA模型。研究这些锰蛋白的结构、性质、功能及其与锰离子的相互作用机制，我们加深了对锰在细胞内转运、代谢、稳态平衡的分子机制和调控机制的理解，揭示了锰转运和调控蛋白的功能变化与锰金属中心环境基因突变的关系，发现了锰代谢疾病与锰转运、代谢过程中关键基因突变的关联，为阐明与锰代谢相关的病理机制，为锰代谢疾病的防治和药物设计提供了依据及思路。