横纹肌肉瘤细胞通过转化生长因子-β对间质成纤维细胞MMP分泌的诱导作用

横纹肌肉瘤（RMS）是起源于向横纹肌分化的原始间叶细胞的软组织肉瘤。本课题研究RMS肿瘤细胞是否通过分泌TGF-β1激活间质成纤维细胞、诱导成纤维细胞分泌MMP从而促进肿瘤的演进，间质成纤维细胞在RMS的演进中是否为积极的参与者。选择不同转移潜能的人RMS细胞3系、人成肌细胞、人真皮成纤维细胞HDF、鼠真皮成纤维细胞MDF，TβRⅡ-KO和Smad4-KO的MDF作为实验对象。用RNAi技术分别建立TβRⅡ和Smad4靶基因缺失的HDF细胞模型；检测外源性TGF-β1是否诱导DF细胞分泌MMP；用2D-coculture system 模拟肿瘤－间质相互作用的移植模型（体外实验）；建立RMS的肿瘤－间质相互作用的动物模型（体内实验）。比较实验组与对照组以及不同转移潜能RMS细胞间的差异。我们力图从新的角度为横纹肌肉瘤的研究提供理论基础。

本课题探讨了TGF-β信号在横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS )细胞生长中的调控作用及其机制。主要结果：1.将shRNA转染RMS细胞系RD细胞。发现TGF-β1刺激经shRNA干扰的RD细胞，胞质中的Smad2/3入核明显减少。2. 应用3H-thymidine 掺入实验、MTT实验、流式细胞术、电镜和激光共聚焦显微镜（LSCM）检测内源性TGF-β/Smad信号转导受阻或外源性TGF-β1刺激对RD细胞生长和凋亡的影响，发现RNA干扰组、 RNA干扰加TGF-β1刺激组及TGF-β1刺激组，细胞生长活力低于正常对照组。流式细胞术检测发现内源性的TGF-β/Smad信号转导受阻和外源性的TGF-β1刺激均可导致RD细胞周期出现G1期的停滞。电镜及LSCM观测发现RNA干扰组和RNA干扰加TGF-β1组有凋亡小体形成。流式细胞术和DNA凝胶电泳检测证实在RNA干扰组和RNA干扰加TGF-β1组细胞出现明显的凋亡现象。3. RT-PCR和Western blot发现TGF-β1在mRNA和蛋白水平上调P27、P21，下调C-myc的表达。免疫共沉淀和体外激酶实验发现TGF-β1上调P27的表达促使结合到CyclinE-cdk2复合体上的P27增加，从而抑制CDK2的磷酸化激酶活性。LSCM发现TGF-β1可促使RD细胞中P27出现表达增强和核周聚集现象，TGF-β1刺激可导致胞核表达的P21弥散到胞质。4．免疫荧光检测发现RD细胞ERK2平均荧光强度显著高于成肌细胞（Mb）。运用RT-PCR技术，发现RD细胞较Mb细胞ERK2、Smad4mRNA水平明显升高。5．给予RD外源性、高浓度TGF-β1刺激，发现TGF-β1刺激RD细胞24h后RD细胞ERK2核内荧光强度增强。6．应用免疫组化检测50例 RMS及23例横纹肌组织中ERK2、Smad4的蛋白表达。结果显示RMS中ERK2和Smad4高表达率显著高于横纹肌组织。相关性研究发现RMS中Ras-MAPK通路为Smad4非依赖类型。结论：TGF-β1/Smad信号及Ras-MAPK均为维持RMS细胞生长所必需。阻断内源性TGF-β1/Smad信号的转导可抑制细胞生长并诱导凋亡。RNAi可望成为临床RMS基因治疗的一种新策略，本课题为进一步拓展研究TGF-β通路的基因治疗提供了新的线索。